Kaspaz Nedir, Kaspazlar
Apoptotik ölüm mekanizmasının önemli yapılarından birisi de kaspazlardır. Bu ailenin üyeleri solucanlardan insanlara kadar pek çok organizmada bulunur (24). Kaspaz enzimleri büyük bir proteaz ailesidir (Şekil 2-4). Aktif merkezlerinde sistein aminoasidi taşırlar ve hedefledikleri proteinleri aspartik asit birimlerinden kestikleri için kaspaz ismini almışlardır (C-Asp-ase; C: sistein aminoasiti simgesi, Asp:aspartik asit, -ase: kesici enzim eki) (107). Kaspazlar ile yapılan kristallografik çalışmalarda yapılarının benzer olduğu gösterilmiştir (56, 82,103). Kaspazlar hücre içerisinde inaktif zimojenler olarak sentezlenirler ve prokaspaz adını alırlar. Bu inaktif prokaspaz enzimleri apoptoz sinyalinin alınmasıyla birlikte aktifleşirler ve aktifleşen bu kaspazlar diğer iaktif kaspazları aspartik birimlerinden keserek aktifleştirirler. Apoptozun belirgin bir özelliği hücresel protein substratların kaspazlar tarafından kırpılmasıdı
Kaspazlar hücrede iki önemli biyolojik yolda görev almaktadırlar; enflamatuar sinyal yolu ve hücre ölüm yolu. Kaspaz ailesinin 7 üyesi (kaspaz-2, -3 ve 6-10) apoptotik ölüm yolunda görev alırken, diğer üçü (kaspaz-1, -4 ve 5 ) proinflamatuar sitokinleri aktifleştirerek savunma sisteminde görev alır. İki yol birbirinden farklı olsa da sitokin aktivatörü kaspazlar ve apoptotik kaspazlar büyük benzerlikler gösterirler (16,24). Bu sınıflandırmaların dışında kalan kaspaz-14 keratinositlerde üretilir ve epidermal farklılaşma sürecinde aktif olarak çalışır
Kaspazlar apoptotik yolda “başlatıcılar” ve “bitiriciler” olmak üzere iki grupta toplanırlar. Apoptotik ölüm işlem sırasına göre kaspazlardan ilk görev alanlar başlatıcı ya da öncü kaspazlardır ve bunların uzun öncül bölgeleri bulunur. Apoptotik yolun daha sonraki aşamalarında görev alan kaspazların diğer üyeleri ise efektör kaspazlar olarak adlandırılır. Efektör kaspazlar başlatıcı kaspazlar tarafından aktiflenirler. Her bir kaspaz enziminin optimum kesme bölgesi vardır ve bu bölge aspartik kesim noktasının N-terminalinde bulunan dört aminoasitlik bir motiftir. Bu motifin görevi, kaspazın hedef proteininin seçimini belirlemektir. Ayrıca bu motif ilgili kaspazın peptid inhibitörlerle inaktive olmasına aracılık etmektir. Kaspaz-2, -8. -9 ve 10 başlatıcı kaspazlardandır, kaspaz-3, 6 ve 7 ise efektör kaspazlardır. Başlatıcı kaspazların üç önemli özelliği vardır; farklı şekillerde gelen uyarıları, genel bitirici faza taşırlar, yeterli miktarda bitirici kaspazın aktifleşmesini sağlayarak apoptotik sinyalin çoğalmasını sağlarlar, ölümün en son basamağında bir kontrol noktası olarak bulunurlar. Kaspazlar hücrede yüzden farklı proteini substrat olarak kullanırlar. Kaspaz-3, 6 ve 7 başlatıcı kaspazlardan farklı olarak kısa bir N-terminal peptid (23-28 aminoasitlik) bulundururlar. Substrat ve inhibitör özgüllüğünde kaspaz-3 ve 7 genellikle benzerdir. Kaspaz-6 ve 7, kaspaz-3 tarafından aktifleştirildiği için bitirici kaspazlar olarak sınıflandırılırlar
Kaspazların Yapıları
Kaspazlar tek bir zincir halinde inaktif zimojen olarak sentezlenirler ve dört bölge içerirler
1. NH2-terminal bölge
2. Büyük alt ünite (20 kDa)
3. Küçük alt ünite (10kDa)
4. Bağlayıcı bölge (katalitik alt üniteleri birbirine bağlar) Bütün prokaspazlar yüksek oranda homolog proteaz bölgesi içerir. Bu bölge iki
alt üniteden oluşmaktadır. Büyük alt ünite yaklaşık 20kDa (p20) ve küçük alt ünite yaklaşık 10kDa (p10) dur (Şekil 2-4). Bazı prokaspazlarda bu alt üniteler arasında 10 aminoasitlik kısa bir bağlayıcı bölge bulunmaktadır. Büyük ve küçük alt birimler birbirleriyle etkileşime girerek enzimin aktif merkezini oluştururlar. Her prokaspaz çeşitli uzunluklarda bir ön bölge veya NH2-terminal peptidbölgesi içermektedir ve bu ön bölgeler düzenleyici olarak görev yaparlar. Kaspazların ön bölgeleri çeşitlilik gösterir. Başlatıcı ve enflamatuar kaspazların 100 aminoasitten daha uzun bir ön bölgesi bulunur. Efektör kaspazlarda ise 30 aminoasitten daha kısa bir ön bölge vardır. CARD ve DED kaspazların ön bölgelerinin özel motifleridir ve protein-protein etkileşiminde görev alırlar. Bu bölgeler prokaspazlar ve adaptörleri arasında homofilik etkileşime aracılık ederek prokaspaz aktivasyonunda önemli rol oynarlar. DED-DED etkileşiminde hidrofobik bir bağlantı kurulur, CARD-CARD ve DD-DD bağlantısında yük etkileşimi gözlenir. Başlatıcı kaspazların kümelenmesi ve aktivasyonu için ölüm reseptörleri ile bağlantı kuran adaptör moleküller bulunur. Bunlardan DED kaspaz-8 ve 10 etkileşiminde, CARD ise kaspaz-9 ve Apaf-1 ile etkileşimde görev alır
Apoptozom Yapisi
Apoptozom Yapısı
Apoptozom yapısı polimorfik özellik göstermektedir. Bazen 7’li bazen 6’lı monomerlerden oluştuğu gözlenmiştir. Apoptozomun merkezi bileşeni olan Apaf-1 proteini yaklaşık 130kDa’luk bir proteindir ve 1194 aminoasitten oluşur. Üç farklı fonksiyonel bölgesi vardır
N-terminal CARD bölgesi
Nükleotid bağlanma ve oligomerizasyon bölgesi (NB-ARC)
12–13 tekrardan oluşan WD40 tekrarları
C-terminal ucu. Kaspaz kümelenme bölgeleri (CARD); Kaspaz-9’un öncülüne homotipik
etkileşim ile bağlanarak, prokaspaz-9 kümelenmesi ve aktivasyonuna aracılık eder (83, 90). Apaf-1 oligomerizasyonu için, sitokrom-c ve dATP varlığında, nükleotid bağlayan bölge gereklidir (90). Bu bölge CARD ile WD40 tekrarları arasındadır ve ATPaz aktivitesi içermektedir. ATPaz aktivitesi ile Apaf-1 molekülünde meydana gelen yapısal değişiklik sonucunda apoptozom kompleksi oluşur. ATPaz bölgesinin kapatılması apoptozom yapısının oluşmasını engeller. WD40 tekrarları iki bölge olarak düzenlenmiştir ve sitokrom-c’nin bağlanması için gereklidir
Oligomerizasyon gerçekleşirken dATP/ATP, Apaf-1’in nükleotid bağlayan bölgesine bağlanır ve hidrolize olur. dATP Apaf-1’e, sitokrom-c ile bağlanmayı sağlayabilmek için inaktif aşamada bağlanır. Daha sonra sitokrom-c, Apaf-1’e bağlanır, dATP hidrolize olur ve multimerik kompleks oluşturur. Son olarakta prokaspaz-9 kümelenmesi gerçekleşir. Aktifleşen kaspaz-9 sonraki aşamalarda görev yapacak kaspazları aktifleştirmek için kompleksten ayrılır). Kaspaz-9’un kompleksten ayrılmasında görev alan WD40 yapısıdır
Elektron mikroskopi çalışmalarında, apoptozomun tekerleğe benzer heptamerik kompleks bir yapı olduğu açığa çıkarılmıştır. Apaf-1’in CARD bölgesi merkezde yer alırken, WD40 tekrarları uzantı kısımlarında bulunmaktadır. Kaspaz-9’un apoptozom ile etkileşime geçmesi apoptozomun merkezinde kubbe şeklinde bir yapı oluşması ile sonuçlanır. Apoptozom kompleksi oluşunca artık kaspaz-9’u aktiflemek için hazırdır
Kaspaz-9’un aktivasyonu ile ilgili iki model ileri sürülmektedir.
1) Hızlandırılmış dimerizasyon modeli: Kaspaz-9 fizyolojik şartlarda monomerler şeklinde bulunur ve yüksek konsantrasyonlarda olmasına rağmen monomer yapılar büyük oranda inaktiftir. Ancak dimer yapıları katalitik olarak aktiftir. Biyokimyasal ve yapısal analizler dimerik kaspaz-9’un sadece bir aktif bölgesinin olduğunu, diğer bölgenin substrat bağlayamadığını göstermiştir. Hızlandırılmış dimerizasyon modelinde heptamerik apoptozom, 7 adet inaktif prokaspaz-9 molekülünü kümelemekte ve bunları birbirine yakınlaştırmaktadır. Apoptozomdaki prokaspaz-9 monomerleri yüksek konsantrasyonlarda ek prokaspaz-9 monomerlerinin de kümelenmesini sağlamakta ve böylece dimerize olarak aktif hale gelmektedirler. Bu modelde apoptozoma bağlı kaspaz-9 molekülleri bağımsız olarak kendi eşlerini kümeleyebilmektedirler. 2) Konformasyon uyarım modeli: Apoptozomda yer alan kaspaz-9’un yüksek katalitik aktivite göstermesi, kaspaz-9’da bir yapısal değişiklik olduğunu ve bu değişikliğinde yüksek Km ve/veya Kcat’i sağladığını göstermektedir. Uyarımlı konformasyon modelinde, yapısal değişiklik kaspaz-9 apoptozomda kümelenmeye başladığında görülür. Bu hipoteze göre; Apaf-1’in CARD bölgesi kaspaz-9 ile multimerik kompleks yapısı oluşturmakta, bu da kaspaz-9 aktivitesinde bir artış ile sonuçlanmaktadır. Apaf-1’in CARD bölgesi sadece kaspaz-9 öncülü ile stabil heterodimer oluşturmaktadır. Bu büyük CARD/kaspaz-9 kompleks oluşumu, kaspaz-9 katalitik alt ünitesi ve Apaf-1’in CARD bölgesi arasında ek bir ara yüz içermektedir. Bu ek ara yüzün kaspaz-9’un ileri aktivasyonu için gerekli yapısal değişikliği hızlandırdığı düşünülmektedir.
Apoptozom yapısı polimorfik özellik göstermektedir. Bazen 7’li bazen 6’lı monomerlerden oluştuğu gözlenmiştir. Apoptozomun merkezi bileşeni olan Apaf-1 proteini yaklaşık 130kDa’luk bir proteindir ve 1194 aminoasitten oluşur. Üç farklı fonksiyonel bölgesi vardır
N-terminal CARD bölgesi
Nükleotid bağlanma ve oligomerizasyon bölgesi (NB-ARC)
12–13 tekrardan oluşan WD40 tekrarları
C-terminal ucu. Kaspaz kümelenme bölgeleri (CARD); Kaspaz-9’un öncülüne homotipik
etkileşim ile bağlanarak, prokaspaz-9 kümelenmesi ve aktivasyonuna aracılık eder (83, 90). Apaf-1 oligomerizasyonu için, sitokrom-c ve dATP varlığında, nükleotid bağlayan bölge gereklidir (90). Bu bölge CARD ile WD40 tekrarları arasındadır ve ATPaz aktivitesi içermektedir. ATPaz aktivitesi ile Apaf-1 molekülünde meydana gelen yapısal değişiklik sonucunda apoptozom kompleksi oluşur. ATPaz bölgesinin kapatılması apoptozom yapısının oluşmasını engeller. WD40 tekrarları iki bölge olarak düzenlenmiştir ve sitokrom-c’nin bağlanması için gereklidir
Oligomerizasyon gerçekleşirken dATP/ATP, Apaf-1’in nükleotid bağlayan bölgesine bağlanır ve hidrolize olur. dATP Apaf-1’e, sitokrom-c ile bağlanmayı sağlayabilmek için inaktif aşamada bağlanır. Daha sonra sitokrom-c, Apaf-1’e bağlanır, dATP hidrolize olur ve multimerik kompleks oluşturur. Son olarakta prokaspaz-9 kümelenmesi gerçekleşir. Aktifleşen kaspaz-9 sonraki aşamalarda görev yapacak kaspazları aktifleştirmek için kompleksten ayrılır). Kaspaz-9’un kompleksten ayrılmasında görev alan WD40 yapısıdır
Elektron mikroskopi çalışmalarında, apoptozomun tekerleğe benzer heptamerik kompleks bir yapı olduğu açığa çıkarılmıştır. Apaf-1’in CARD bölgesi merkezde yer alırken, WD40 tekrarları uzantı kısımlarında bulunmaktadır. Kaspaz-9’un apoptozom ile etkileşime geçmesi apoptozomun merkezinde kubbe şeklinde bir yapı oluşması ile sonuçlanır. Apoptozom kompleksi oluşunca artık kaspaz-9’u aktiflemek için hazırdır
Kaspaz-9’un aktivasyonu ile ilgili iki model ileri sürülmektedir.
1) Hızlandırılmış dimerizasyon modeli: Kaspaz-9 fizyolojik şartlarda monomerler şeklinde bulunur ve yüksek konsantrasyonlarda olmasına rağmen monomer yapılar büyük oranda inaktiftir. Ancak dimer yapıları katalitik olarak aktiftir. Biyokimyasal ve yapısal analizler dimerik kaspaz-9’un sadece bir aktif bölgesinin olduğunu, diğer bölgenin substrat bağlayamadığını göstermiştir. Hızlandırılmış dimerizasyon modelinde heptamerik apoptozom, 7 adet inaktif prokaspaz-9 molekülünü kümelemekte ve bunları birbirine yakınlaştırmaktadır. Apoptozomdaki prokaspaz-9 monomerleri yüksek konsantrasyonlarda ek prokaspaz-9 monomerlerinin de kümelenmesini sağlamakta ve böylece dimerize olarak aktif hale gelmektedirler. Bu modelde apoptozoma bağlı kaspaz-9 molekülleri bağımsız olarak kendi eşlerini kümeleyebilmektedirler. 2) Konformasyon uyarım modeli: Apoptozomda yer alan kaspaz-9’un yüksek katalitik aktivite göstermesi, kaspaz-9’da bir yapısal değişiklik olduğunu ve bu değişikliğinde yüksek Km ve/veya Kcat’i sağladığını göstermektedir. Uyarımlı konformasyon modelinde, yapısal değişiklik kaspaz-9 apoptozomda kümelenmeye başladığında görülür. Bu hipoteze göre; Apaf-1’in CARD bölgesi kaspaz-9 ile multimerik kompleks yapısı oluşturmakta, bu da kaspaz-9 aktivitesinde bir artış ile sonuçlanmaktadır. Apaf-1’in CARD bölgesi sadece kaspaz-9 öncülü ile stabil heterodimer oluşturmaktadır. Bu büyük CARD/kaspaz-9 kompleks oluşumu, kaspaz-9 katalitik alt ünitesi ve Apaf-1’in CARD bölgesi arasında ek bir ara yüz içermektedir. Bu ek ara yüzün kaspaz-9’un ileri aktivasyonu için gerekli yapısal değişikliği hızlandırdığı düşünülmektedir.
Apoptozom Nedir
Apoptozom Nedir
Apoptozom, kaspaz–9’u aktifleştiren bir oligomerik sinyal platformudur. Apoptozom yapısının oluşması için sitokrom-c ve dATP/ATP gereklidir. Yaklaşık 1,4MDa’luk bir kompleks olan apoptozomun oluşumu mitokondriyondan sitokrom-c salındıktan sonra gerçekleşir. Apaf-1, kaspaz-9’un aktivasyonunu sağlamaktadır. Apaf-1 apoptotik uyarı olmadığı zamanlarda sitoplazmada monomerik şekilde bulunmaktadır. Sitokrom-c sitoplazmaya kaçtığında, Apaf -1 oligomerize olup tekerleğe benzer bir şekil alır ve apoptozomu oluşturur. Bu yapı mitokondriyon yolunun ve kaspaz-9’un aktivasyonu için anahtar rol oynar. Apoptozomda yer alan Apaf-1’in CARD bölgesi, prokaspaz-9’un CARD bölgesi ile etkileşime geçerek, çok sayıda prokaspaz–9 molekülünün kümelenmesini sağlayarak otoaktivasyonlarına aracılık eder. İzole aktif kaspaz–9 enzimine kıyasla apoptozoma bağlı kaspaz–9’un üç kat daha fazla aktiviteye sahip olması, bu molekülün aktivitesinin apoptozom tarafından arttırıldığının göstergesidir. Prokaspaz-9 kırpılmadan da katalitik olarak aktiftir ve aktivitesi apoptozom tarafından kırpılarak arttırılır
Apoptozom, kaspaz–9’u aktifleştiren bir oligomerik sinyal platformudur. Apoptozom yapısının oluşması için sitokrom-c ve dATP/ATP gereklidir. Yaklaşık 1,4MDa’luk bir kompleks olan apoptozomun oluşumu mitokondriyondan sitokrom-c salındıktan sonra gerçekleşir. Apaf-1, kaspaz-9’un aktivasyonunu sağlamaktadır. Apaf-1 apoptotik uyarı olmadığı zamanlarda sitoplazmada monomerik şekilde bulunmaktadır. Sitokrom-c sitoplazmaya kaçtığında, Apaf -1 oligomerize olup tekerleğe benzer bir şekil alır ve apoptozomu oluşturur. Bu yapı mitokondriyon yolunun ve kaspaz-9’un aktivasyonu için anahtar rol oynar. Apoptozomda yer alan Apaf-1’in CARD bölgesi, prokaspaz-9’un CARD bölgesi ile etkileşime geçerek, çok sayıda prokaspaz–9 molekülünün kümelenmesini sağlayarak otoaktivasyonlarına aracılık eder. İzole aktif kaspaz–9 enzimine kıyasla apoptozoma bağlı kaspaz–9’un üç kat daha fazla aktiviteye sahip olması, bu molekülün aktivitesinin apoptozom tarafından arttırıldığının göstergesidir. Prokaspaz-9 kırpılmadan da katalitik olarak aktiftir ve aktivitesi apoptozom tarafından kırpılarak arttırılır