Mikronükleus Oluşumu
Mikronükleuslar, bölünen hücrelerde kardeş nükleuslara katılamayan asentrik kromozom fragmentleri veya tüm kromozomlardan ortaya çıkan küçük ve extranüklear oluşumlardır
Mikronükleus içeriğindeki kromozomal fragmantler, direkt DNA çift iplik kırıklarından, hücre replikasyonu sonrası SSB (tek iplik kırığı)’lerin DSB (çift iplik kırığı)’lere dönüşümünden veya DNA sentez hatalarından sonuçlanır. İki kromozom kırığının onarılamayışı bir disentrik kromozom ve bir asentrik fragment üreten bir asimetrik kromozomun yeniden düzenlenmesine öncüllük edebilir. Sıklıkla disentrik kromozomların sentromerleri anafazda, kardeş nükleuslar arasında nükleoplazmik köprü (NPB) oluşturacak şekilde hücrenin zıt kutuplarına doğru çekilir ve bir asentrik fragment de MN oluşturur. Mikronüklus içeriğindeki tüm kromozomlar öncelikle kromozom ayırım makinesindeki kusurlardan dolayı oluşur. Mesela bunlar, hücre siklüsünü kontrol eden genlerdeki eksiklerden, mitotik iğdeki hatalardan, kinetokordan veya mitotik aygıtın diğer parçalarından veya kromozomal altyapılardaki hasarlardan, mekaniksel bozulmadan ve sentromerik DNA’nın hipometilasyonundan kaynaklanır.
Mikronükleus skorlanması oldukça kolay, ekstra kültür işlemi basamağı olmadan uygulanabilir ve insan biyomonitöringinle alakalı farklı hücre tiplerinde (lenfositler, fibroblastlar ve epitel hücrelerinde) kullanılabilir. Fenech ve Morley şimdilerde geniş olarak kullanılan bir method olan Sitokinez- bloklu MN (CBMN) deneyi’ni geliştirerek MN’lerin binükleat hücrelerde daha kolaylık ve güvenilirlikle skorlanmasını sağladılar
CBMN’nin en önemli avantajı, sırasıyla yapısal ve sayısal CA’lara öncülük eden klastojenik ve anojenik olayların ikisini birden ortaya çıkarmakta yatar. Standart in-vitro mikronükleus deneyi insan lenfositlerinde uygulanır ve klasik teste göre insan lenfositleri mitozu stimüle eden phytohaemagglutinin (PHA) öncülüğünde kültüre edilirler 44.saatten sonra cytochalasin-B (Sit-B) kültüre ilave edilir. Bu aktin polimerizasyonu inhibitörünün kullanılışı, binükleat hücrelerin ve mononükleat hücrelerin arasındaki ayırıma izin veren sitokinezi bloke etmesidir. 72. saatte hücreler mikroskopik slaytlara ekilirler, sabitlenirler ve boyanırlar. Periferik kan lenfositlerindeki kromozom hasarlarının ölçümünde MN tekniğinin kullanılması ilk kez Countryman ve Heddle tarafından sunulmuştur. MN testi mutajenisite (bir mutasyon başlatma yeteneği) testleri için güvenilir bir deneydir. Her bir hücredeki nükleus sayısı, cytochalasin-B ilavesi ile nükleer bölünmelerin sayısını göstermektedir. Bu teknikte yalnızca binükleat (iki çekirdek içeren) hücreler sayılmaktadır çünkü bu hücreler sadece bir kez hücre bölünmesi geçirmiş hücre grubudur
MN frekansı için skorlanan sitokinez-bloklu hücrelerin aşağıdaki karakteristliklere sahip olması gerekir:
1. Hücreler binükleat olmalıdır.
2. Binükleat hücredeki iki nükleus intakt nükleer membrana sahip olmalıdır ve aynı sitoplazmik sınırlar içinde bulunmalıdır.
3. Binükleat hücredeki iki nükleus yaklaşık olarak eşit büyüklükte, eşit boyama yoğunluğu ve eşit boyama oranında olmalıdır.
4. Binükleat hücredeki iki nükleus, büyük nükleusun çapının 4’te birinden geniş olmamak şartı ile çok ince bir nükleoplazmik köprü ile bağlanabilir.
5. Binükleat hücredeki iki ana nükleus birbirne dokunabilir ama üstü üste binemezler. Üst üste iki gelen nükleuslu bir hücre, herbir nükleusun nükleer sınırları ayırt edilebilir olduğu sürece sklorlanabilir.
6. Binükleat hücrenin sitoplazmik sınırı veya membranı intakt olmalı ve açık şekilde bitişik hücrelerin sitoplazmik sınırlarından ayırt edilebilir olmalıdır
MN skorlama kriterleri;
1. İnsan lenfositlerinde MN’nin çapı ana nüklusun çağının 1/16 ile 1/3’ü aralığında olmalıdır. Bu da sırasıyla, BN hücredeki ana nükleusundan birinin alanının 1/256 ve 1/9’u ile uyumludur.
2. MN’ler yuvarlak ve oval şekillerdedir.
3. MN’ler ışığı kırmazlar ve bu nedenle boya partükülleri gibi artefaktlardan kolayca ayırt edilebilirler.
4. MN’ler ana nükleusa bağlanmazlar veya birleşmezler.
5. MN, ana nükleusa dokunabilir ama üst üste gelemez ve mikronükleer sınırlar nükleer sınırlardan ayırt edilebilir olmalıdır.
6. MN genellikle ana nükleus ile aynı boya yoğunluğuna sahip olmalıdır, fakat bazen daha şiddetli de olabilir