Polimorfizm Nedir ve Genetik Polimorfizm
Poli ve morfizmos kelimelerinden oluşan polimorfizm, eski Yunanca’da "çok şekillilik” anlamı taşıyan bir sözcüktür.
Genetik polimorfizm, bir popülasyonda, farklı allellere bağlı olarak, genetik olarak belirlenmiş iki ya da daha çok alternatif fenotipin görülmesidir.
Popülasyon genetikçileri, bir gen lokusu için, nadir alleller en az %1 frekansına sahip ve bu alleller için heterozigotlar en az %2 oranında görülürlerse polimorfık olarak tanımlarlar. Popülasyon genetiği açısından belli bir frekansa gereksinim olmasına karşın, moleküler biyoloji açısından, frekansın önemi olmayıp, bir ailede dahi görülen varyant, polimorfık olarak adlandırılmaktadır.
Polimorfızmler, türlerin bulundukları ortama adaptasyonlarını kolaylaştırarak, evrimsel süreçte ayakta kalabilmelerine olanak verir.
Polimorfizm, tüm birey düzeyinde (fenotip), proteinlerin ve kan grubu bileşiklerinin varyant formlarında (biyokimyasal polimorfizm), kromozomların morfolojik Œzelliklerinde (kromozomal polimorfizm) ya da DNA düzeyinde nükleotid farklılıkları (DNA polimorfizmi) şeklinde gelebilir.
Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP)
Adından da anlaşılacağı gibi bu polimorfizm tipinden tek bir nükleotid sorumludur. SNP’lerin çoğu, tek bir nükleotidin bir başka nükleotidle yer değiştirmesi şeklindedir. Ancak SNP tanımı, tek bir nükleotidin insersiyon ya da delesyonunu da içerir (Basit Indel Delesyonları). Bazı SNP’ler ise kesim belgelerinde değişimlere yol açar (Kesim Belge Polimorfizmleri, RSP: Restriction Side Polymorphism). İnsan genomunun yaklaşık %1,5’i, kodlayan DNA dizileri i„erir ve SNP’lerin „oğu intron ve intergenik diziler gibi kodlama yapmayan DNA bŒlgelerinde şekillenir
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ilgilenilen spesifik DNA dizilerinin, iki oligonükleotid primeri kullanılarak enzimatik olarak sentezlendiği bir in-vitro moleküler biyoloji tekniğidir. PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA bŒlgelerinin sentezinin birka„ saat i„inde ger„ekleştirilmesi ve çok az miktarda DNA ile „alışmaya olanak sağlaması, bu teknolojinin yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur. YŒntem 1983 yılında Kary Mullis tarafından keşfedilmiş ve Mullis, bu keşfinden dolayı kimya dalında Nobel Œdülünü kazanmıştır (Mullis KB. ve Faloona FA., 1987).
Günümüzde polimeraz zincir reaksiyonu, kalıtımsal hastalıkların saptanması, bulaşıcı hastalıkların tanısı, doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesi, adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi (analık-babalık tayini), tarım (tohum saflığının belirlenmesi), sistematik ve evrim çalışmaları (doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfızmin belirlenmesi) ve DNA computing (silikon kökenli bilgisayar teknolojileri yerine DNA molekülü ve moleküler biyoloji yöntemleri kullanılarak yapılan bir hesaplama türü) gibi oldukça geniş bir alanda kullanılmaktadır.
Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenilen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı olan, bir çift sentetik oligonükleotid primeri kullanılarak, bu iki primerin 5' uçları ile sınırlandırılmış olan bölgenin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır. Oligonükleotid primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle birleşirler. Bir PCR döngüsü sırasıyla, DNA çift zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılması (denaturation), sentetik oligonükleotid primerlerin hedef DNA bölgesine bağlanması (annealing) ve primerlerin yeni DNA zincirini oluşturacak şekilde uzaması (extension) aşamalarından meydana gelir. Ardı ardına tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve uzama evreleriyle DNA fragmentleri üssel olarak artar. Böylece, 20 döngülük bir PCR sonucunda tek bir hedef diziden yaklaşık bir milyon kopya (220) oluşturulur. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primer için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır. PCR boyunca biriken ürünlerin boyu iki primerin boyu ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı kadardır.
Bir PCR döngüsü için gerekli olan beş ana bileşen vardır:
1. Çoğaltılmak istenen DNA fragmentini (tek bir gen, genin bir bölümü ya da DNA’daki kodlamayan bir dizi) içeren kalıp DNA
2. Çoğaltılacak bölgenin başlangıç ve bitiş bölgesini belirleyecek olan iki adet oligonükleotid primeri
3. Taq Polimeraz ya da başka bir ısıya dayanıklı polimeraz enzimi
4. DNA polimerazın kalıp DNA’dan sentezleyeceği yeni zincir için kullanacağı Deoksiribonükleotid-trifosfatlar (dNTP)
5. Kullanılan DNA polimeraz için uygun bir kimyasal çevre sağlayacak olan tampon karışımı