Mutasyon Tarama Yöntemleri
Kalıtsal hastalıkların prenatal ya da postnatal tanısı, veya populasyonda taşıyıcı taraması yapılarak hastalıkların önüne geçilmesi, aileye ve bireye verilen hem maddi, manevi hasarın önlenmesinde hem de topluluklar için gen frekanslarının belirlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Tanıyı kolaylaştırmak için bugüne kadar, pek çok mutasyon tarama yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemler, süre, pratik uygulanabilirlik, maliyet gibi özellikleri göz önünde tutularak kullanılır (19).
Küçük delesyonlar, insersiyonlar ve nokta mutasyonları için tek zincir konformasyon polimorfizm analizi (SSCP) (20), heterodubleks analizi (HA) (21), denatüre edici jel elektroforezi (DGGE) (22), restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP), allel spesifik amplifikasyon (ASA) (23) ve DNA dizi analizi gibi çeşitli mutasyon tarama teknikleri tanımlanmıştır. Mutasyon taraması için kullanılacak, metodun seçiminde gözönüne alınabilecek başlıca kriterler şunlardır; hangi tip biyolojik materyalin kullanılacağı, hangi tip nükleik asitin analiz edileceği, saptanacak mutasyonun daha önceden bilinip bilinmediği, saptanacak potansiyel mutasyonların ne kadar fazla olduğu, kullanılacak metodun ne kadar güvenilir olduğu ve ne ölçüde standardize edilebileceği, testin nasıl uygulanacağı, rutin tanı için uygun olup olmadığı, testin maliyeti ve kalite değerlendirmesi
Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi (SSCP)
Tek zincir konformasyon polimorfizmi (SSCP) analizi, bilinmeyen mutasyonların saptanması için kullanılan polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) bağlı bir mutasyon tarama yöntemidir. Bu yöntem nokta mutasyonlarının yanısıra küçük insersiyon ve delesyon mutasyonlarının saptanmasında tercih edilmektedir. Özellikle gen dizisi büyük olan proteinlerde dizi analizi yapılacak bölgeyi önceden saptamak amacı ile genin taranmasında en sık kullanılan yöntemlerden biridir ve DNA dizi analizine iyi bir alternatiftir. Mutasyon saptama oranı %80 ile %90 arasında değişmektedir. Bu analiz restriksiyon enzim analizini, blotting’i, problar ile hibridizasyonu gerektirmediğinden hızlı ve pratik bir yöntemdir.
Bu yöntemde PCR ürünleri denatüre edilir ve denatüre edici olmayan poliakrilamid jele uygulanır. Denatüre edilerek tek zincir haline getirilmiş DNA’ların zincir içi zayıf bağlarla kazandıkları yeni ikincil yapıları mutasyon sonucu değişebilir. Mutasyon sonucu oluşan bu ikincil yapıda oluşan konformasyon farkı o bölgenin elektroforezdeki hareketinde normal kontrol ile karşılaştırıldığında bir kaymaya, farklılığa neden olur. SSCP analizi genellikle tek iplikli DNA’daki konformasyon değişikliklerinden yararlanılarak mutasyonun varlığını tahmin etmekte kullanılmaktadır. Çift iplikli DNA’daki değişiklikleri göstermeyen bir yöntemdir.
Her SSCP analizi için optimal koşulların belirlenmesi gerekir. Analiz edilecek DNA parçasının büyüklüğü, jelin özellikleri (kullanılan poliakrilamid ile gliserol konsantrasyonu, denatüran ajan varlığı), elektroforez sırasında tercih edilen sıcaklık, elektroforez zamanı, PCR ürünlerinin denatürasyon yöntemi, mutasyonun tipi ve bulunduğu yer performansı etkiler.
SSCP analizinde en iyi sonuç, DNA 150-200 baz çifti uzunluğunda olduğu zaman elde edilir. Uzunluğu 150 baz çifti altında olan DNA fragmanlarında ikincil yapının oluşmasındaki güçlük nedeni ile SSCP analizinin duyarlılığı azalmaktadır. 200 baz çifti üzeri büyüklüğe sahip DNA’larda ise tek baz değişikliği ile daha az konformasyon değişikliği oluşacağı için bunun jelde görünmesi güçleşmekte ve büyük parçaların analizinde tespit edilen mutasyonların sayısı düşmektedir. Tek zincirli DNA’nın konformasyonu sıcaklığa hassastır. 17oC nin altı ve 23oC üzerindeki sıcaklıklar tek zincirli DNA’nın yarı stabil şekillerini bozabilmektedir. En iyi rezolüsyonu elde edebilmek için en çok tercih edilen oda sıcaklığıdır. Elektroforez sırasında jellerin ısıtılması önlenmelidir. 5V/cm voltajda 4W da ortalama 22oC de elektroforez yapıldığında jel fazla ısınmamakta ve jelin ısınma miktarı önemsiz olmaktadır. İçinden sıvı sirkülasyonu olan elektroforez sistemleri pahalı olmakla birlikte sıcaklığı standardize ettikleri için uygun sistemlerdir. İyi bir sonuç için yeterli hava konveksiyonu da gereklidir.
SSCP analizinde DNA parçalarını ayırmak için sıklıkla kullanılan matriks akrilamiddir.
Akrilamid/bisakrilamid oranı, toplam akrilamid ve gliserol yüzdesi, tampon içeriği jelin ayırma özelliğini belirler, en fazla tercih edileni, düşük çapraz bağlayıcı oranı ve %10 gliseroldür. Bazı SSCP’ler için yüksek yüzdeli jellerin kullanılması önerilmiştir. TEMED ve APS ile polimerize edilmiş, akrilamid benzeri hidrolink isimli jelin tek bir tipte gözenek büyüklüğüne sahip olduğu ve akrilamidden daha iyi rezolüsyon sağladığı belirtilmiştir. Yüksek rezolüsyon için ticari olarak bir çok özel jel matriksleri mevcuttur.
Şimdiye kadar rapor edilmiş jel uzunlukları 5-50 cm arasında değişmektedir. SSCP analizinde sonuçlar görsel değerlendirildiğinden iyi bir rezolüsyonun sağlanabilmesi için jelin boyutlarının uzun olması (yaklaşık 30x40 cm), elektroforez işlemlerinin düşük voltajda, uzun sürede yapılması ve ince bir jelin kullanılması gereklidir. Son yıllarda yapılan bir çok uygulamada standart sekans jelleri yerine mini jeller kullanılmıştır. Kısa jellerde keskin bant farklılıklarının gözlendiği bildirildiği halde %0,5 lik kayma farklılığının gözlenebilmesi için uzun elektroforezler tercih edilmelidir.
SSCP analizi için PCR ürünlerinin temiz ve spesifik olması gereklidir. Spesifik olmayan PCR ürünleri, kullanılmamış primerlerin varlığı, PCR siklus sayısının fazlalığı yanlış yorumlanabilecek bantlara neden olabilir. Genel olarak PCR ürünleri 96 oC de ısıtılarak denatüre edilir. Tek zincir haline gelmiş DNA lar hemen buz üzerine alınır ve hızla jele uygulanır. Örneğe güçlü denatüranların eklenmesi veya örneklerin 10-30 kat seyreltilmesi tek zincirlerin kendi kendine çift zincir oluşturmalarını en aza indirir. Denatüran olarak formamid, sodyum hidroksit, üre ve metil merkürik hidroksit kullanılabilir. Metil merkürik hidroksit toksiktir ama en etkili denatürandır. Özellikle ince jeller kullanıldığında denatüre edilmiş dilüe PCR ürünleri jele uygulandıkları noktada konsantre olurlar ve bir miktar renatürasyon gerçekleşir. Bu nedenle her zaman çift zincir DNA bantları tek zincir DNA bantlarından daha güçlü gözlenir.
daha iyi gözlenebilmesi için DNA'nın mümkün olduğunca sulandırılması gerekir. İnce jeller kullanıldığında tek zincir DNA'ların gözlenmesinde radyoaktif işaretleme, gümüş boyama ve etidyum bromide üstünlük sağlar.
Mutasyonun tipi ve bulunduğu yer SSCP analizinin duyarlılığını etkilemektedir. Mutasyon ikincil yapıya katılıyorsa SSCP analizinde mutasyon kolaylıkla saptanabilecektir. Eğer mutasyonun ikincil yapıyı oluşturmada rolü yoksa, mutasyon saptanmayabilir. Pürin içeriğinin daha fazla olduğu DNA tek zinciri jelde daha hızlı yürümekte ve daha belirgin değişiklikler göstermektedir. Guaninin Timine transversiyonu haricinde herhangi tip baz değişikliğinin sensitivite üzerine belirgin etkisi yoktur. Bir dizide heterozigot olarak bir değişim bulunuyorsa, bu dizinin SSCP analizi sonucunda dört farklı tek zincir DNA bandı oluşumu beklenir. Bunlar; normal allelin anlamlı ve anlamsız dizileri, ve mutant allelin anlamlı ve anlamsız dizileridir.SSCP analizi özel bir ekipmana ihtiyaç göstermeyen bir yöntem olduğu için basit ve hızlı bir tarama yöntemidir. SSCP analizinde mobilite farklılıkları görsel olarak değerlendirilir. Bu yüzden standardizasyonu kısıtlı ve otomasyona geçirilmesi de zordur. Optimal koşullar büyük oranda ampirik olarak tanımlanmıştır. Bir fragmanın farklı koşullarda analiz edilmesi mutasyonların tespit edilebilme olasılığını arttırır