Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nedir

Mutasyon Analizlerinde Kullanılan Yöntemler

Hemofili B hastalığında, faktör IX geninde bulunan mutasyonlar üzerinde yapılan çalışmalar faktör IX gen ürününün yapısı ve fonksiyonu ile regülasyonu arasmdaki ilişkileri göstermesi bakımından önem arz etmektedir. Ayrıca bu mutasyonlann karakterizasyonu, doğru taşıyıcı tanısı yapılması ve prenatal tam testlerinin geliştirilmesi için doğrudan klinik uygulamaya sahiptir.

Tam amaçlı yapılan ilk moleküler çalışmalarda yüzlerce hemofili B ailesinde Restriksiyon fragment uzunluk polimorfizm [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)]'lerinin kullanılmasının gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu [Polymerase Chain Reaction (PCR)] ve PCR'ı temel alan teknolojilerin geliştirilmesinin ardından hastalığa sebep olan mutasyonlar belirlenmiştir. Bu sayede birçok laboratuarda hastalığın direkt tanısı olanaklı hale gelmiştir. Ancak pozisyonu bilinen mutasyonlarda yapılabilen direkt gen analiz yöntemleri, yüksek heterojenite gösteren faktör IX gibi gen yapılarında etkisiz kalmış ve gelişen moleküler tam teknolojileri ile mutasyon tarama analizleri (DGGE, SSCP gibi) yapılmıştır. Uygulama alam bulmasına rağmen, tam amaçlı mutasyon tarama çalışmalarının tümünün fazla zaman harcanmasının yamsıra yetersiz duyarlılığa sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca bu metodlar sonunda mutasyon tespiti için referans metod olarak kabul edilen DNA baz dizi analizini (sequencing) gerektirmektedir

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

DNA ve RNA analizi için kullanılan tüm teknikler değerlendirildiğinde, 1985'te Salki ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve kavramsal olarak basit bir prosedür olan polimeraz zincir reaksiyonu en fazla potansiyele sahip ve DNA analizlerinde yeni bir çağı başlatan tek yöntemdir. Polimeraz zincir rekasiyonunda birkaç saat içerisinde tek bir DNA ya da RNA molekülü birkaç milyon katına amplifiye edilebilmektedir. Bu yeteneği nedeniyle saç kökünden, ağız çalkantısındaki birkaç hücreden, kurumuş bir kan damlasından elde edilen tek bir hücreden izole edilen DNA materyalinden gerekli tüm analizlerin gerçekleştirilmesi mümkün olmaktadır.

Polimeraz zincir reaksiyonu incelenmek istenen DNA fragmentinin laboratuarda tüp içerisinde 5' ve 3' uçlarına özgü bu bölgelerdeki baz dizilerine komplementer bir çift primer kullanılarak, bu iki primer ile sınırlandırılan DNA parçasının enzimatik olarak bir milyon kez çoğaltılmasıdır. Bu yöntemin uygulamaya konması ile geniş kullanım alam bulmasındaki ana neden, tek bir hücreden izole edilen DNA'nın amplifikasyonu sonrası farklı analizlerde kullanılmasını olanaklı kılmasıdır. Polimeraz zincir reaksiyonunda DNA amplifikasyonu;

a. Denatürasyon (denaturation)

b. Bağlanma (annealing)

c. Uzama (extension) basamaklarından oluşan bir döngünün 25-30 kez tekrarlanması ile gerçekleşir.