İnsitu Hibridizasyon Nedir

İnsitu Hibridizasyon

İn situ hibridizasyon teknikleri, morfolojik olarak korunmuş kromozomlarda, hücrelerde veya doku kesitlerinde spesifik nükleik asid dizilerinin tayinini sağlar. DNA veya RNA'nın spesifik dizilerinin belirlenmesine imkan veren nükleik asid hibridizasyon tekniği, bu nükleik asidlerin tek iplik segmentlerinin daha önceden işaretlenmiş, bilinen tamamlayıcı nükleik asid serilerine spesifik olarak, bağlanabilme yeteneğine dayanır. Bu bilinen diziler laboratuvarda üretilip prob olarak adlandırılır ve radyoizotop veya biotin veya digoxigeninli nukleotidlerin eşleşmesiyle işaretlenir. İzotop işaretli prob otoradyografi ife, biotin işaretli prob ise avidine yüksek afinitesi ile, digoxigenin ise alkalin fosfataz ile belirlenebilir.

Nonizotopik in situ hibridizasyon, kimyasal olarak modifiye edilen DNA problarının immünolojik ya da afinite reaksiyonları ile fluoresan veya enzimatik ofarak görüntülenmesi prensibine dayanır. Nonradyoaktif ISH metodlan 2 tipe ayrılır.

1) Direkt metodda; saptanacak molekül (fluorescein) nükleik asid probuna direkt olarak bağlıdır. Hedef nukfeik asidle hibridizasyondan sonra oluşan hibrid mikroskopda görülebilir.

2) İndirekt metodda; prob tayin edilecek molekülü kimyasal veya enzimatik olarak taşır ve bu immunositokimya yardımı ile tayin edilir. Saptanacak molekül antikorlara kolayca bağlanır. Böylece birçok hapten modifikasyonları tarif edilmiştir. Bunlardan ilk kullanılanı biotin-streptavidin sistemidir. İndirekt yöntemler daha hassastır.

İmmunohistokimya Nedir

İmmünohistokimya Nedir

immünohistokimya; belli bir dokuda bulunan antijenlerin gösterilmesi için işaretlenmiş antikorların kullanılmasıdır. Belirli antijenler içeren doku kesiti, bu antijenlere karşı işaretlenmiş antikorlar içeren bir solüsyonda inkübe edildiği zaman, antikorlar spesifik olarak antijenlere bağlanır.Böylece antijen-antikor komplekslerinin yerleşimleri ya ışık (immünohistokimya) ya da elektron mikroskopla (ultrastrüktürel immunositokimya) gözlenebilir.

İmmunohistokimyasal metodlar uygulanışlarına göre ikiye ayrılır. 1) Direkt metodda; antijene karşı oluşturulan antikor işaretlenerek ( bu bir enzim veya fluoresan bir madde veya radyoaktif madde veya bir metal olabilir), antijen-antikor kompleksi esasına göre sonuç alınır. 2) İndirekt metod; herhangi bir antijene karşı antikor çeşitli hayvanlarda üretilir, örn; tavşan. Tavşan immunoglobulinleri, keçi ve koyun gibi bir başka hayvanda, bir antikor cevabının başlatılmasından sorumlu olup, böylelikle bir antiantikor oluşur. Antijeni içeren bir doku kesiti işaretlenmemiş tavşan antiantikorlan ile inkübe edilir. Yıkamadan sonra, işaretlenmiş tavşan antiantikorlan eklenir ve antijenin yeri işaretlemeye uygun olan mikroskopla görülebilir. Her bir antiantijen antikoru, işaretlenmiş antiantikorun bazı moleküllerini bağladığı için indirekt yöntem direkt yöntemden daha duyarlıdır. İndirekt immun işaretleme yöntemlerinden biri olan Streptavidin Biotin Peroksidaz tayin yöntemi şekil 3 de görülmektedir.

Streptavidin, Streptomyces avidinii'den izole edilen bir proteindir. Streptavidin molekülü ( 60 kD) herbiri bir biotin molekülüne bağlanabilen 4 subüniteye sahiptir. Biotin, çeşitli proteinlere ve nükleik asitlere bağlanabilen, suda çözünen bir vitamindir. Streptavidin-biotin sistemi, streptavidin ve biotin arasındaki kuvvetli bağlanma özelliğine (Kd=10"15 M) dayanır. Bu yöntemde primer antikora bağlanan, biotin ile işaretlenmiş ikinci antikor kullanılır. Horse Radish Peroksidaz (HRP) işaretli streptavidin, biotinle işaretli ikinci antikora bağlanır. Kromojen/substrat solüsyonu olarak AEC ( 3-amino-9-ethylcarbozole) kullanılır ve dokudaki antijen/antikor/enzim kompleksi etrafında yoğun kırmızı renk reaksiyonu oluşur