Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH)
Moleküler biyoloji hastalıkların genetik etiyolojisinin anlaşılmasına yardımcı birçok yeni tekniklerin gelişimine yol açmıştır. Bunlardan biri olan FISH sitogenetik ve gen haritalaması çalışmalarında yaygın deneysel tekniklerden biri haline gelmiştir. Bu yöntem genellikle moleküler sitogenetik olarak adlandırılmaktadır
DNA molekülü gelişen teknolojiyle beraber incelenmesi en kolay moleküllerden biri haline gelmiştir. Belirli bir DNA parçası sınırsız şekilde çoğaltılabilmekte, nükleotid dizileri çok kısa sürede saptanabilmekte, aynı tekniklerdeki varyasyonlar ile izole bir gen değiştirilebilmekte ve tekrar kültürdeki hücrelere verilmektedir. Tüm bu gelişmeler rekombinant DNA teknolojisi adı altında toplanan ve 1970’li yıllardan itibaren takip edilmesi güç bir hız ile geliştirilen teknikler sayesinde olmuştur. Bu ilerlemelere ortam hazırlayan üç temel gelişme vardır:
1. DNA’nın spesifik bölgelerden restriksiyon enzimleri ile kesilmesi,
2. Saflaştırılmış DNA fragmentindeki tüm nukleusların sekanslanması,
3. Nükleik asitlerin kendilerine komplementer olan diğer bir nükleik asit fragmenti ile karşılıklı gelebileceği ilkesi ile DNA-DNA, DNA-RNA yada RNA-RNA fragmentleri arasında hibridizasyonun yapılmasıdır
Floresanlanmış nükleotid analoglarının direkt ve indirekt ISH (In Situ Hibridizasyon ) yöntemlerinde kullanılmaya başlamasıyla (1991) bir alt dal oluşmuştur ki bu da FISH’dir. FISH ile komplementer DNA fragmentleriyle spesifik nükleik asit sekansları hibridize edilmekte, böylece kromozom kopya sayıları ve genlerin lokalizasyonları belirlenebilmektedir. Karyotip analizleri veya konvansiyonel metafaz sitogenetiğiyle karşılaştırıldığında, FISH büyük avantajlar sağlamaktadır. Kromozomların interfazda da bir alan oluşturdukları ve spesifik problarla bu alanların yapı ve kısmen miktarı konusunda bilgi alınabileceği görülmüş ve böylece ISH ile ‘’interfaz sitogenetiği’’ analizi adı verilen alt bir dal doğmuştur. İnterfaz nukleusunda kromatin metafaz kromozomlarından daha az kondensedir ve böylece high rezolusyon FISH için doğal hedef olmuştur. Metafaz kromozomlarında rezolüsyon >1 Mb yüksek rezolüsyonla uzatılmış kromozomlarda rezolüsyon >200 kb iken, interfaz nukleusunda bu değer 1 kb’dır
FISH doku kültürüne ihtiyaç duyulmadan solid tümörlere hatta formolde fikse edilmiş, parafin bloklu dokulara dahi uygulanabilmektedir. Anöploidilerin değerlendirilmesinde FISH Flow Cytometry’den daha hassastır. Artık DNA anöploidisi ve prognoz arasınaki ilişkinin tayininde FISH uygulanmaktadır.
FISH tekniğinin tanı ve araştırma amaçlı kullanım alanlarını şöyle sıralayabiliriz:
A) Tanısal amaçlı kullanılan FISH
1. Klinik sitogenetik
a. Prenatal tanı
b. İnterfaz sitogenetiği
c. Mikrodelesyon sendromlarının tanısı
d. Kanser sitogenetiği
2. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısı
3. Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin değerlendirilmesi
B) Araştırma amaçlı FISH
1. Gen haritalaması
2. Tümör biyolojisi
3. Mikrobiyoloji/viroloji
4. Gen ekspresyon analizi
5. Somatik hücre hibrit analizleri
6. Mayoz/mitoz analizleri
7. Hücre tanımlaması
Tüm ISH yöntemlerinde temel prensip aynıdır. Prob olarak kullanılan DNA molekülü işaretlenir, yani eksojen olarak reaksiyona sokulan işaretli nükleotid, prob DNA’sındaki uygun nükleotid ile yer değiştirir. Prob işaretlendikten sonra lam/lamel üzerine fikse edilen metafaz ve/veya interfazdaki proteinler uzaklaştırılır, çift sarmal halde bulunan gerek prob gerekse hedef DNA’lar denatürasyon ile tek zincir haline getirilir. Önceden işaretlenmiş prob ile spesifik eşleşmenin olacağı uygun koşullarda genomik DNA hibridize edilir.
Multipl Myelom MM Tedavisi
MM’da hastalığın evresine, klinik bulguların şiddetine bağlı olarak radyoterapi ve kemoterapi uygulanabilir. Ayrıca ağrı, anemi, hiperkalsemi gibi eşlik eden bulgular için semptomatik tedaviler uygulanır.
Hastalık tam olarak iyileştirilemez fakat tedavi edilebilir ve sağ kalım süreleri tümör yükü ile bağlantılıdır. Beş yıllık sağ kalım %30, 10 yıllık sağ kalım %3’tür. Myelomda tedavi komplekstir ve kemoterapi, radyasyon ve cerrahiyi içerir. Tedavinin hedefi; sağ kalım süresini uzatmak, ağrıları ve iskelet komplikasyonlarını azaltıp yaşam kalitesini arttırabilmektir. Bunun için, yeni ilaçlar, yeni kombine kemoterapiler, VAD (Vincristin-adriamisin-deksametazon), yüksek doz MP (Melfalan) ve kök hücre tedavisi uygulanmaktadır. Otolog veya allojenik kök hücre nakli yanı sıra Biphosphanate’lar, rekombinant α-interferon ve gerektiğinde antimikrobiyal etkenler kullanılmaktadır. Destekleyici tedavi genellikle hastalığın komplikasyonlarına bağlı ciddi morbiditeyi önlemeyi amaçlar
Prognostik Faktörler
Hastalar uygulanan tedavi yöntemlerinden hangisinin uygun olacağını belirten açık bir yaklaşım yoktur. Ancak prognostik faktörlerin varlığı ve bilinmesi hastalara uygulanacak tedavilerin belirlenmesinde önemli yer tutmaktadır. MM için belirlenmiş önemli prognostik faktörler şunlardır:
1. β2 mikroglobulin: en önemli ve güvenilir prognostik faktördür; tümör yükü ve böbrek bozukluğuyla ilgili bilgi verir. Yüksek β2 mikroglobulin düzeyleri erken ölümle ilişkilidir.
2. C-reaktif protein (CRP): Serum CRP konsantrasyonu myelom hücreleri için önemli bir büyüme ve yaşam faktörü olan IL-6 aktivitesini yansıtır. CRP ve β2 mikroglobulin düzeyleri 6mg/ml den yüksek oldugunda ise prognoz oldukça kötüdür (ortalama yaşam süresi 6 ay)(24).
3. Plazma Hücreleri İşaretlenme İndeksi (PCLI): Plazma hücrelerinin çoğalma akivitesini yansıtır. Hastalığın erken dönemlerinde birçok miyeloma hastasında çoğalma düşüktür. Hastalık ilerledikçe indeks artış gösterir.
4. Laktik dehidrogenaz: Tedavi almamış olguların yaklaşık %10’unda LDH seviyesi yüsek bulunur. Bu daha sıklıkla yüksek tümör kitlesi, ekstramedüller hastalık ve hipodiploidi olan hastalarda görülür.
5. Myelomlu hastaların %18-30’unda; delesyon, anöploidi ve translokasyon şeklinde sitogenetik anomaliler görülmektedir. Özellikle 13q delesyonları, t(4;14) ve p53 gen kaybı kötü prognoz ile ilişkilidir
Multipl Myelom MM Nedir
Multipl Myelom (plazma hücreli myelom, myelomatozis veya Kahler hastalığı) kemik iliğinde monoklonal immünglobulin (M protein) yapan plazma hücrelerinin kontrolsüz olarak klonal artışı ile karakterize kronik, progresif ve fötal bir hastalıktır. MM aşırı monoklonal immunoglobulin (IgG, IgA, IgD, IgE) veya Bence-Jones protein (serbest monoklonal κ veya λ hafif zinciri) yapımıyla kendini belli eden ve sıklıkla hiperkalsemi, anemi, böbrek hasarı, bakteriyal enfeksiyonlara karşı duyarlılığın artması ve yaygın olarak pelvis, omurga, kaburgalar ve kafatasında yaygın osteoporozla karakterizedir
MM malign hastalıkların yaklaşık %1’ini, hematolojik malignansilerin %10’unu ve tüm kanser ölümlerinin %2’sini oluşturur. Son yıllarda kemik iliği incelemesi ve protein elektroforezi gibi yardımcı tekniklerin kullanılmasıyla görülme sıklığınının arttığı bildirilmektedir (7). MM’un yıllık insidansı, beyaz ırkta yaklaşık 100.000’de 4’tür. MM erkeklerde kadınlardan daha sık görülür esas olarak ileri yaş hastalığıdır. En sık görüldüğü yaş grubu 65-70’dir. Hastaların sadece %3’ü 40 yaşın altındadır. Ancak son yıllarda yaş ortalaması 50-55’e doğru kayma eğilimindedir
Hastalık ilk kez 19. yüzyılın ortalarında tanımlanmıştır. İlk myelom hastası 1844 yılında Solly tarafından bildirilmiştir. Henry Bence Jones hastaların idrarında anormal bir protein tanımlamıştır. Von Rustizky 1873 yılında multipl kemik tümörü olan bir hastada multipl myelom terimini ilk kez kullanmıştır. Plazma hücresi terimi ilk kez 1875 yılında Wladeyer tarafından kullanılmıştır. Dr. Otto Kahler tarafından 1889’da kemik ağrısı, anemi ve proteinürisi olan 46 yaşında bir hasta rapor edilmiştir
Normal B Hücre Gelişimi ve Multipl Myeloma
Kan hücrelerinin tümü kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök hücreden yapılır. Plazma hücreleri de kök hücreden yapılan B lenfositlerinin birçok evrelerden geçerek farklılaşmasıyla oluşmaktadır. B lenfositler; olgunlaştıkları organlarda, periferik kanda, lenf düğümü foliküllerinin germinal merkezlerinde ve dalakta bulunur. Periferik kan lenfositlerinin %15-20’si B lenfositleridir (11). Plazma hücrelerinin temel görevi antikor üreterek yabancı ajanlara karşı vücut savunmasını güçlendirmektir. İnsan vücudu doğumdan itibaren sürekli farklı antijenlerle karşılaşmaktadır. Bu antijenlerle karşılaşan B lenfositler antijenlere karşı uygun tipte ve gerekli miktarda antikor üretecek olan plazma hücrelerine dönüşürler. Her yeni zararlı antijene karşı uygun antikor üretecek yeni plazma hücrelerinin yapımı kontrollü şekilde devam eder
Multipl Myeloma Tanı Kriterleri
Antikorlar immünglobulin (Ig) yapısındadır. İmmünglobulinler 2 uzun (ağır zincir) ve 2 kısa zincirden (hafif zincir) oluşmaktadır. İmmünglobulinlerin 5 majör sınıfı vardır. Her bir sınıf ağır zincirin tek tipine sahiptir. Bunlar; Gamma (IgG), alfa (IgA), mü (IgM), epsilon (IgE) ve delta (IgD)
İmmünglobulin ağır (H) ve hafif (L) zincirlerin sentezi ayrı genler tarafından yönetilmektedir. İnsan antikor genleri üç gruptur; Bunlar kappa (κ) ve lamda (λ) olmak üzere iki hafif zincir (L) ve bir ağır zincir (H) gen bölgeleridir. Kappa hafif zincir geni 2 nolu, Lambda hafif zincir geni 22 nolu ve ağır zincir geni 14 nolu kromozom üzerinde yer almaktadır.
İmmünglobulinleri ve T hücre reseptörlerini kodlayan tüm gen tipleri için yaklaşık 1018 olası kombinasyonlu farklı mekanizmalar bulunmaktadır. Sonuç olarak yüksek oranda değişken bölgelerde düzenli olarak oluşan DNA dizi değişiklikleri (somatik mutasyonlar) olası kombinasyonların total sayısının daha fazla artmasına neden olur
İmmünglobulin genlerini oluşturacak DNA düzenlenmesi B hücre gelişiminin çok erken dönemlerinde görülmektedir. Ağır zincir genlerin düzenlenmesi ilk erken pro-B evresinde DH, JH gen segmentlerinin bir araya gelmesiyle başlamaktadır. Geç pro-B hücrelerinde bir VH segmeti DJH segmentine katılarak VH-DJH şeklinde düzenlenmekte ve pre-B evresi oluşmaktadır. Pre-B hücrelerinde, V-DJ bağlanmasıyla membranda düşük, sitoplazmada yüksek oranda tam µ (mü) ağır zinciri oluşmaktadır. Ağır zincir oluştuktan sonra ağır zincir gen düzenlenmesi durmakta, hafif zincir V-J gen düzenlenmesi başlamaktadır. Hafif zincir genleri düzenlenmesi ile immatür B hücrelerine dönüşüm için hücre yüzeyinde ağır-hafif zincirli Ig molekülleri tamamlanmakta ve hücreler yüzey IgM reseptörlü immatür B hücre şeklini alarak farklılaşma sonlanmaktadır. Bazen RNA’nın işlemden geçmesi sırasında aradaki intron uzaklaştırılırken Cµ de uzaklaştırılır ve VDJ kompleksi Cδ’ya yakınlaşır sonuçta IgD ekspresyonu olur
Plazma Hücre Diskrazileri PHD Nedir
İmmünglobulin salgılayan hücrelerin anormal çoğalması, kan veya idrarda monoklonal gammopatinin bulunması ile karakterize bir grup hastalığa “plazma hücre diskrazisi” denir. Kanda artış gösteren bu immünglobuline M protein denir. İmmünglobulinlerdeki aşırı artış nedeniyle bu hastalık grubu için monoklonal gammopati, disproteinemi veya paraproteinemi terimleri de kullanılır. En çok orta ve ileri yaş grubunda ortaya çıkar. Bu hastalıkların başlıcaları şunlardır
Malign Monoklonal Gammopatiler
Multipl Myelom (IgG, IgA, IgD, IgE ve hafif izncir) ve tipleri
Smoldering (sessiz) multiple myelom
Plazma hücre lösemisi
Nonsekretuar myelom
Osteosklerotik myelom (POEMS sendromu)
Soliter kemik plazmositoması
Ekstramedüller plazmositom Myelom, neoplastik plazma hücreleri tarafından üretilen monoklonal immunglobulin, kappa veya lambda hafif zincir üretimiyle karakterizedir. İmmünglobülinlerin normal serum konsantrasyonu, myelomun çesitli immünglobulin tiplerinin frekansı ile paraleldir. En yaygın myelom tipleri IgG ve IgA’dır. IgG tüm myelomlu vakaların % 60 ile % 70 ini, IgA ise vakaların %20 sini oluşturur. Az sayıda vakada ise IgD ve IgE myelom rapor edilmiştir. Myelom hastalığında kanda M proteini yüksek seviyede olmasına rağmen, MM’li hastaların yaklaşık %15-20’sinde immünglobülinler tam üretilemez ve yalnızca immunglobulinin hafif zincir bölümünü oluşturur. Bu hastalara Bence Jones myelom denir. Bu hastaların idrarında M protein bulunur. Bence-Jones proteini (idrarda artmış hafif zincir) oluşumu ile böbrek tubüllerinde hasar oluşmakta ve bu durum böbrekte fonksiyon bozukluğuna sebep olmaktadır. Bence-Jones proteinler rutin idrar analizi ile belirlenemez.
İmmünoelektroforez adlı test ile idrarda Bence Jones proteininin tam miktarı belirlenebilmektedir
