Adenovirusların Genel Özellikleri
Adenoviruslar çift iplikli DNA içeren, orta büyüklükte (65-75 nm), çıplak virüslerdir. Viriyonun DNA ve ilişkili proteinler içeren özyapısı 252 kapsomerden oluşan ikozahedral bir kapsidle çevrilidir. İkozahedron 20 eşkenar yüzü ve 12 köşesi olan bir polihedrondur. Adenoviruslar ikozahedral virüslere örnek olarak verilebilirler
Toplam kapsomer sayısı 252’dir. Bunun 12’si penton (köşelerde yer alan kapsomerler), 240’ı hekzondur (yüzeyde yer alan kapsomerler). İkozahedral kapsidin eşkenar üçgen yüzünde yer alan her kapsomer 6 komşu kapsomerle çevrilidir ve hekzon adını alır. Köşelerde bulunan kapsomerlerin herbiri 5 komşu kapsomerle çevrilidir ve penton adını alır. Bir ikozahedral yapıda 12 köşe olduğuna göre total kapsomer sayısı ne olursa olsun daima 12 penton bulunur. Penton kapsomeri 2 yapısal kısımdan oluşur. Bunlardan köşede bulunan kapsomer alt yapısı “penton baz” ve bunlardan çıkan uzantı “fiber” olarak adlandırılır
Fiber antijeninin uzunluğu tiplere göre farklılık gösterir. Adenovirusların nötralizasyon testi ile tiplere ayrılmasında anti-fiber antikorlarının rolü büyüktür. Penton antijeni virüslerin hücre kültürlerinde oluşturduğu erken sitopatik etkiden (CPE) sorumludur ( Fields et al. 1996).
Hekzon antijeninde iki önemli antijenik determinant saptanmıştır. Bunlardan birisi tipe özgüllüğü belirlemekte, diğeri ise tipler arasındaki çapraz reaksiyonları ortaya çıkarmaktadır (http://www-micro.msb.le.ac.uk/default.html:Virology:Adenoviruses, 2005).
Adenovirus taneciklerinin ayrıntılı olarak üç boyutlu yapısal modelleri, kriyoelektron mikroskobisi ve x-ray kristallografi kombinasyonlarına dayanılarak yapılmıştır. Buna göre, adenovirus kapsidinde en fazla 10 protein vardır (Stewart et al. 1991)
Genom
Doğrusal, segmentsiz, çift iplikli DNA, gruptan gruba değişmekle birlikte 30-38 kb büyüklüğündedir. Adenovirus yapısının %13’ü DNA, %87’si proteindir (Green and Pina 1963, Ishibashi and Maizel 1974, Şimşek 1993). Genom yapısı grup içinde virüslerin tespitinde kullanılan karakterlerden biridir (Harrington et al. 2004).
Replikasyon
Bütün adenovirusların replikasyonu benzerdir ve çekirdekte meydana gelir. Çünkü çift iplikli DNA virüslerinden olan Adenoviridae ailesinin üyeleri replikasyon ve transkripsiyon için hücresel faktörlere gerek duyarlar. Bu faktörler arasında DNA polimeraz ve RNA polimeraz II gibi replikaz ve transkriptazlar yer alır. Bu enzimler hücre çekirdeğinde bulunduğundan adenoviruslar da hücre çekirdeğinde replike olurlar.
Adenoviruslar kendi DNA polimerazlarını kodlarlar, ancak, RNA polimerazları olmadığından çekirdekteki transkripsiyon donanımlarını kullanmak zorundadırlar
Apoptoz ve Kanser
Kanser, genetik bir hastalıktır. Normal hücrelerin kanser hücresi haline geçişi sırasında birçok biyokimyasal olay gerçekleşmektedir. Transformasyon ve buna bağlı olarak kanser oluuşmunda, hücre büyüme sinyallerinin kontrol mekanizmasındaki bozukluklar ve apoptozdan kaçış rol oynamaktadır. Bu sıralama daha sonra, anjiyogenezin uyarılması, hücre adezyonunu kontrol eden faktörlerin aktivasyon kaybı ile tümörün çevre dokulara yayılmasında artış ve son olarak da metastaz yeteneğini kazanma olarak devam eder. Kanser hücreleri tek bir hücreden veya birden fazla sayıdaki malign klondan kaynaklanırlar.
İmmortalite, genetik instabilite, kontakt inhibisyonun kaybı ve metastaz kanser hücrelerinin özellikleri içinde yer alır
Kanserogenezin temelinde hücrenin yaşamının devamı, büyümenin kontrolü ve farklılaşma gibi biyolojik olayları etkileyen mutasyonların aşamalı olarak bir araya gelmesi yer almaktadır. Hücre proliferasyonu ve hücre ölümü arasında homeostatik dengenin düzenlenmesi, çok hücreli organizmaların gelişim süreci ve doku devamlılığı için çok önemlidir. Aşırı hücre artışı apoptoz ile dengelenir. Apoptozu kontrol eden genlerin ekspresyonlarındaki veya fonksiyonlarındaki değişimler bu dengeyi bozar ve neoplastik hücre çoğalmasına katkıda bulunurlar. Kanserin gelişim sürecinde tümör hücreleri birçok fenotipik özellikler kazanır. Bu değişimler, tümör hücrelerinin hızlı ve sınırsız çoğalmalarına ve çevre dokuya yayılmalarına neden olur. Ayrıca bu hücreler mikroçevreden bağımsız olarak yaşamını devam ettirme ve metastaz yapma özelliğine sahiptir. Protoonkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin seri mutasyonları farklı mekanizmalar aracılığıyla malign fenotipin oluşumuna katkıda bulunur
Onkogenler ve tümör baskılayıcı genler apoptozun düzenlenmesinde rol alırlar. Apoptozun azalması kanser hücrelerine avantaj sağlamaktadır. Kaspaz genlerinde ortaya çıkan mutasyonlar ile çeşitli maligniteler arasında ilişki bulunduğu bildirilmiştir. Kaspaz-5’teki çerçeve kayması mutasyonu ailesel nonpoliposis kolorektal kanserlerde, gastrointestinal ve endometrium tümörlerinde, Kaspaz-3 geninde homozigot delesyonlar meme kanser hücrelerinde (MCF-7) gözlenmiştir. Apoptozu baskılayan protein ailesinin üyeleri ile ilgili değişikliklere de bazı kanser tiplerinde rastlanmıştır. Survivin’in aşırı ekspresyonu meme kanserinde gösterilmiştir
Apoptozun mitokondriyon yolunun ana düzenleyici proteinleri Bcl-2 ailesidir. Bcl-2 ailesine ait proteinlerin miktarlarındaki değişiklikler ile çeşitli kanser tipleri arasında ilişki bulunmuştur. Major non-Hodgkin lenfomada kromozom translokasyonu ile apoptozu engelleyen Bcl-2 geni aktifleşir. Bcl-2 geninin prostat kanseri, meme kanseri, küçük hücreli akciğer karsinomu ve melanoma gibi solid tümörlerde aşırı ekspresyonu gözlenir. Bax’ın fonksiyon kaybına neden olan mutasyonlar gastrointestinal ve çeşitli kanser türlerinde gösterilmiştir
Apoptoz ile ilişkisi saptanan ilk tümör baskılayıcı gen p53’tür. P53 genindeki bir mutasyon veya fonksiyon kaybı kansere neden olur. P53 apoptozda önemli bir kontrol noktası proteini olarak iş görmektedir. DNA hasarı tamir edilemediğinde apoptozu ilerleten Bax, Noxa ve Puma proteinlerini aktifleyerek, yaşam faktörü olan Bcl-2 ve Bcl-XL’yi baskılayarak hücreyi apoptoza yönlendirir. P53 ayrıca Apaf-1 ve kaspaz-9 ile ölüm sinyallerini alan DR5, Fas, TNF-alfa reseptör proteinlerinin de ekspresyonlarını arttırarak apoptoza katılır. Bazı tümörlerde p53’ün transkripsiyonlarını kontrol ettiği apoptoz yolundaki bazı proteinlerin (Mdm-2, ARF, Apaf-1, Kaspaz-9, Noxa, Puma ve Bax) mutasyonları gözlenmiştir
Kaspaz Nedir, Kaspazlar
Apoptotik ölüm mekanizmasının önemli yapılarından birisi de kaspazlardır. Bu ailenin üyeleri solucanlardan insanlara kadar pek çok organizmada bulunur (24). Kaspaz enzimleri büyük bir proteaz ailesidir (Şekil 2-4). Aktif merkezlerinde sistein aminoasidi taşırlar ve hedefledikleri proteinleri aspartik asit birimlerinden kestikleri için kaspaz ismini almışlardır (C-Asp-ase; C: sistein aminoasiti simgesi, Asp:aspartik asit, -ase: kesici enzim eki) (107). Kaspazlar ile yapılan kristallografik çalışmalarda yapılarının benzer olduğu gösterilmiştir (56, 82,103). Kaspazlar hücre içerisinde inaktif zimojenler olarak sentezlenirler ve prokaspaz adını alırlar. Bu inaktif prokaspaz enzimleri apoptoz sinyalinin alınmasıyla birlikte aktifleşirler ve aktifleşen bu kaspazlar diğer iaktif kaspazları aspartik birimlerinden keserek aktifleştirirler. Apoptozun belirgin bir özelliği hücresel protein substratların kaspazlar tarafından kırpılmasıdı
Kaspazlar hücrede iki önemli biyolojik yolda görev almaktadırlar; enflamatuar sinyal yolu ve hücre ölüm yolu. Kaspaz ailesinin 7 üyesi (kaspaz-2, -3 ve 6-10) apoptotik ölüm yolunda görev alırken, diğer üçü (kaspaz-1, -4 ve 5 ) proinflamatuar sitokinleri aktifleştirerek savunma sisteminde görev alır. İki yol birbirinden farklı olsa da sitokin aktivatörü kaspazlar ve apoptotik kaspazlar büyük benzerlikler gösterirler (16,24). Bu sınıflandırmaların dışında kalan kaspaz-14 keratinositlerde üretilir ve epidermal farklılaşma sürecinde aktif olarak çalışır
Kaspazlar apoptotik yolda “başlatıcılar” ve “bitiriciler” olmak üzere iki grupta toplanırlar. Apoptotik ölüm işlem sırasına göre kaspazlardan ilk görev alanlar başlatıcı ya da öncü kaspazlardır ve bunların uzun öncül bölgeleri bulunur. Apoptotik yolun daha sonraki aşamalarında görev alan kaspazların diğer üyeleri ise efektör kaspazlar olarak adlandırılır. Efektör kaspazlar başlatıcı kaspazlar tarafından aktiflenirler. Her bir kaspaz enziminin optimum kesme bölgesi vardır ve bu bölge aspartik kesim noktasının N-terminalinde bulunan dört aminoasitlik bir motiftir. Bu motifin görevi, kaspazın hedef proteininin seçimini belirlemektir. Ayrıca bu motif ilgili kaspazın peptid inhibitörlerle inaktive olmasına aracılık etmektir. Kaspaz-2, -8. -9 ve 10 başlatıcı kaspazlardandır, kaspaz-3, 6 ve 7 ise efektör kaspazlardır. Başlatıcı kaspazların üç önemli özelliği vardır; farklı şekillerde gelen uyarıları, genel bitirici faza taşırlar, yeterli miktarda bitirici kaspazın aktifleşmesini sağlayarak apoptotik sinyalin çoğalmasını sağlarlar, ölümün en son basamağında bir kontrol noktası olarak bulunurlar. Kaspazlar hücrede yüzden farklı proteini substrat olarak kullanırlar. Kaspaz-3, 6 ve 7 başlatıcı kaspazlardan farklı olarak kısa bir N-terminal peptid (23-28 aminoasitlik) bulundururlar. Substrat ve inhibitör özgüllüğünde kaspaz-3 ve 7 genellikle benzerdir. Kaspaz-6 ve 7, kaspaz-3 tarafından aktifleştirildiği için bitirici kaspazlar olarak sınıflandırılırlar
Kaspazların Yapıları
Kaspazlar tek bir zincir halinde inaktif zimojen olarak sentezlenirler ve dört bölge içerirler
1. NH2-terminal bölge
2. Büyük alt ünite (20 kDa)
3. Küçük alt ünite (10kDa)
4. Bağlayıcı bölge (katalitik alt üniteleri birbirine bağlar) Bütün prokaspazlar yüksek oranda homolog proteaz bölgesi içerir. Bu bölge iki
alt üniteden oluşmaktadır. Büyük alt ünite yaklaşık 20kDa (p20) ve küçük alt ünite yaklaşık 10kDa (p10) dur (Şekil 2-4). Bazı prokaspazlarda bu alt üniteler arasında 10 aminoasitlik kısa bir bağlayıcı bölge bulunmaktadır. Büyük ve küçük alt birimler birbirleriyle etkileşime girerek enzimin aktif merkezini oluştururlar. Her prokaspaz çeşitli uzunluklarda bir ön bölge veya NH2-terminal peptidbölgesi içermektedir ve bu ön bölgeler düzenleyici olarak görev yaparlar. Kaspazların ön bölgeleri çeşitlilik gösterir. Başlatıcı ve enflamatuar kaspazların 100 aminoasitten daha uzun bir ön bölgesi bulunur. Efektör kaspazlarda ise 30 aminoasitten daha kısa bir ön bölge vardır. CARD ve DED kaspazların ön bölgelerinin özel motifleridir ve protein-protein etkileşiminde görev alırlar. Bu bölgeler prokaspazlar ve adaptörleri arasında homofilik etkileşime aracılık ederek prokaspaz aktivasyonunda önemli rol oynarlar. DED-DED etkileşiminde hidrofobik bir bağlantı kurulur, CARD-CARD ve DD-DD bağlantısında yük etkileşimi gözlenir. Başlatıcı kaspazların kümelenmesi ve aktivasyonu için ölüm reseptörleri ile bağlantı kuran adaptör moleküller bulunur. Bunlardan DED kaspaz-8 ve 10 etkileşiminde, CARD ise kaspaz-9 ve Apaf-1 ile etkileşimde görev alır
