Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (PCR/RFLP)
PCR/RFLP yöntemi ile mutasyonun araştırılacağı gen bölgesi, mutasyonu içine alacak şekilde çoğaltılır. Uzunluğunu bildiğimiz genomik DNA parçası, bakılacak mutasyona özgü olan restriksiyon endonukleaz enzimi yardımıyla kesilir. Kesilen genomik DNA, parçalarının büyüklüğüne göre agaroz ya da poliakrilamid jelde elektroforez işlemi ile yürütülür. Jel tercih edilen yönteme bağlı olarak, hazırlanmadan önce veya elektroforezden sonra etidyum bromür ile boyanıp ardından ultra viyole (UV) ışıkta görüntülenir. Kesim noktalarına göre
uzunlukları önceden bilinen parçalar değerlendirilerek mutasyonların varlığı ya da yokluğuna karar verilir.
Değerlendirme şu şekilde yapılır; hedef gen bölgesindeki nokta mutasyon, çoğaltılan DNA’da seçilen restriksiyon enziminin tanıma bölgesine özgülse mutasyonlu üründe kesim gerçekleşirken normal üründe kesim gerçekleşmez. Böylece kesilen ürünlere sahip bireyler mutasyonlu diğerleri normaldir. Tam tersine restriksiyon enziminin tanıma bölgesi mutasyona özgül değil de normal olan ürüne özgül ise kesim normallerde gerçekleşir, mutasyon olanlarda kesim gerçekleşmez. Değerlendirme, kesim olan ürünlere sahip bireyler normal, olmayanlar ise mutasyonludur şeklinde yapılır (25).
DNA Dizi Analizi
DNA dizi analizi DNA'nin nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir. Nükleotid dizilerinin
belirlenmesinde iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlar Maxam-Gilbert kimyasal degradasyon yöntemi ile Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemidir. Her iki yöntemin de dizi analizi yapılacak DNA'nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana aşaması bulunmaktadır.
a. Maxam-Gilbert Yöntemi: DNA parçası bir ucundan P32 ile işaretlenir. Bu işaretlenen DNA parçası dört örnek olarak bölünür. Her örneğe, DNA'daki bazlardan birisini tahrip edecek sekilde bir kimyasal madde eklenir. Daha sonra, piperidine kullanılarak, hasarlanmış nükleotidlerin bulunduğu yerlerden DNA yapısı fosfodiester bağlarından kırılır. Böylece P32 ile işaretlenmiş kısalı-uzunlu parçalar elde edilmiş olur. Daha sonra elektroforez ve otoradyografi ile sonuç alınır.
b. Sanger DNA dizi analiz yöntemi: En sık kullanılan Sanger'in yöntemi olup, asimetrik amplifikasyon ile elde edilmiş tek iplikçikli DNA; DNA Polimeraz enzimi ile ddNTP ve biri radyoaktif olarak işaretlenmiş dNTP kullanılır. Ortama radyoaktif P32, S35 veya P33 eklenir. İşaretleme primerlere yapılabileceği gibi, ortama eklenen dNTP'lerden birisinin radyoaktif olması yeterlidir. Burada en önemli nokta Dideoksinükleotidlerin (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) eklenmesidir. 2',3' Dideoksinukleosidtrifosfat’ ların (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP'lerden farklılığı deoksiribozun 3' noktasında hidroksil grubunun bulunmamasıdır. Büyüyen/sentezlenen DNA zincirine, DNA polimerazlar aracılığı ile bağlanabilirler. Bu bağlanma 5' trifosfat grupları aracılığı ile olur. Fakat, 3' hidroksil grubunun olmaması nedeniyle, ardından gelen dNTP'ler ile fosfodiester bağının oluşması engellenir. Doğal olarak DNA zincirinin daha fazla uzaması imkansız hale gelir. ddNTP ile klasik dört dNTP bir reaksiyon karışımının içine konduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarış olur, seyrek fakat spesifik sonlanmalar oluşur. Bu reaksiyon sonucunda, primer sonundan başlayıp; prematüre sonlanmaların olduğu bölgeler kadar uzunluktaki DNA parçaları ortaya çıkar. Dört farklı enzimatik reaksiyonda, dört farklı ddNTP kullanılarak (A,C,G,T için) birer reaksiyon elde edilir.
DNA dizi analizi süreci, tek iplikçikli DNA parçalarının hazırlanması; DNA dizi analizi tekniğinin uygulanması; DNA dizilerinin okunması-değerlendirilmesi ve ispatlayıcı tekrarlar biçimindedir. Eger dikkatli yapılırsa hata oranı %0.1'in altındadır. Bu hata oranına ulaşmak için; hedef DNA'nın her iki zincirine dizi analizi yapmak gereklidir
