Nor Bölgeleri Genel Özellikleri
Çekirdekçik oluşturan bölgeler(NOR’lar), insanda bulunan 5 çift akrosentrik kromozomların yani 13, 14, 15, 21 ve 22. kromozom çiftlerinin ikincil boğumu olarak nitelendirilen satellit saplarında bulunan ribozomal DNA’ları (rDNA) ifade ederler . NOR’lar, rDNA’nın çok sayıda kopyalarını içeren kromozomal bölgeler olup NOR başına rDNA kopyalarının sayısı farklıdır. rDNA yüksek miktarda guanin ve sitozin içeriğine sahiptir.
rDNA, transkripsiyonel olarak hepsinde aktif olmasa da kısa kollarını yitirmemiş tüm insan akrosentrik kromozomlarında bulunur. Marsupial PtK1 hücrelerinde eğer ki bir NOR, transkripsiyonel olarak aktif değilse, genellikle fakültatif heterokromatin durumda bulunduğu ileri sürülmektedir. Transkripsiyonel olarak aktif olan NOR’lar inaktif olan NOR’lardan belirli bir uzaklıkta bulunurlar. Çekirdekçik içinde bulunan rDNA, transkripsiyonel olarak aktiftir).
1961’den beri, insanda 10 akrosentrik kromozomun kısa kollarının saplar taşıdığı ve yumru şeklinde satellitleri olduğu kabul edilmektedir. Bu bölgeler çekirdekçiğin yapımında işe karıştıkları için, sitogenetik açıdan öneme sahiptirler.
İnsan hücrelerinin metafazlarında, NOR taşıyan akrosentik kromozomların kısa kolları sık sık bir arada bulunurlar buna satellit birleşmesi (Satellite Association) denir. Daha fazla miktarda RNA içeren NOR’ların daha sık olarak satellit birleşmelerine katıldıkları ve yine aynı şekilde aktif NOR’ların inaktif olanlardan çok daha fazla sıklıkta bu birleşmelere katıldıkları ileri sürülmüştür.
NOR PROTEİNLERİ
NOR proteinlerinin gümüşe, belirli ilgileri vardır. Asidik şartlar altında birçok hücresel protein boyanmadan kalırken, NOR proteinleri, bu koşullarda gümüşü indirgeme yetenekleri sayesinde boyanırlar ve diğer hücresel proteinlerden ayırt edilmeleri sağlanır.
NOR proteinleri, aktif ribozomal genlerin bir göstergesi sayılırlar. Gümüş boyama ile ortaya çıkarılan AgNOR proteinlerinin miktarının, transkripsiyonel aktivite ve hücre çoğalması ile doğrudan ilişkili olduğu ileri sürülmektedir
Aktif transkripsiyon ve çoğalma sırasında tanımlanan ana AgNOR proteinleri, protein B23 ve nükleolinlerdir.
Nükleonin; insan hücrelerinde 105kDal ağırlığında bir fosfoproteindir. rRNA moleküllerinin transkripsiyonunda önemli rol oynar. %5’den daha az miktarı mitoz sırasında ribozomal genlerle bağlı kalır. Nükleonin yapısal bir fonksiyona da sahiptir
Protein B23; 38–39 kDal ağırlığında bir fosfoproteindir. Daha çok sitoplazmada bulunur. Öncül ribozomal parçaların organizasyonunun son aşamasında görev alırlar
AgNOR proteinleri, elektron mikroskobu ile özellikle çekirdekçiğin ipliksi merkez ve yoğun ipliksi bölgelerinde bulunurlar. İnterfaz çekirdeğinde granüllü bölgeden dışarı atılırlar. Farklı miktarlardaki AgNOR proteinleri ince bir flament ile oluşan granüllere bağlanırlar.
AgNOR proteinlerinin, düzenli olarak hücre çoğalması ve nükleolar aktiviteyi değerlendirmek için kullanıldığı ve kanser hücresinin erken tanısı için bir ölçüt olduğu belirtilmektedir. Ökaryot hücreler rRNA sentezini hızlı bir şekilde düzenleyen mekanizmaya sahiptirler. Bu düzenleme, memeli hücreleri temel aminoasitlere ihtiyaç duyduğu zaman gözlenir ve mekanizmanın kontrolüne ribonükleoproteinler katılmaktadır
NOR‘LARIN GÜMÜŞ NİTRAT İLE BOYANMASI
İnterfaz ya da mitoz sırasında transkripsiyonel olarak aktif olan NOR’ların yerleşimi gümüş boyama ile gösterilebilmektedir. Ribozomal genlerin aktif transkripsiyonel bölgesi ile gümüş boyanırlılığı arasında doğrudan ilişki vardır. Ancak mitotik NOR’ların gümüşle boyanabilmesi için NOR, kromatinin hücre döngüsünün bir önceki interfazında transkripsiyonel aktif olması gerektiği ileri sürülmektedir
Gümüş nitrat, 1880’li yılların sonlarından beri sitolojik bir boya olarak kullanılmaktadır. Kromozom preparatlarında AgNOR boyama ilk olarak 1920 yılında Carleton tarafından gösterilmiştir (19). Sitogenetik preparatlara AgNOR boyama tekniği, 1975 yılında Goodpasture ve Bloom tarafından çekirdekçik oluşturan bölgeleri ortaya çıkarmak amacı ile geliştirilmiştir. Bu teknik, 1980’de Howell ve Black tarafından basitleştirilerek ışık ve elektron mikroskobu alanlarında uygulanmıştır.
Gümüş boyama tekniği, asidik bir ortamda gümüş nitratın NOR proteinleri tarafından metalik gümüşe indirgenmesine dayanır. NOR boyama DNAaz ya da RNAaz‘lardan etkilenmezken, pronaz, tripsin ya da papain gibi proteolitik enzimlerden etkilenmektedir. Buda bize gümüş nitratı metalik gümüşe indirgeyen asıl maddenin DNA ya da RNA olmayıp bu bölgelere NOR proteinleri olduğunu gösterir. Gümüş boyanmaya neden olan materyalin, interfaz boyunca üretildiği ve profazda NOR’ların etrafında biriktiği ileri sürülmektedir
Çekirdek ekstraktlarından elde edilen jel elektroforezinde gümüşe bağlanan proteinlerin bir kısmı gösterilmiştir. Gümüşe proteinlerin bağlanma reaksiyonu sülfidril grupları vasıtasıyla meydana geliyor gibi görülmektedir. rDNA’lar transkripsiyonunu katalizleyen RNAP- I bu şekilde tanımlanan ilk proteindir.
Fosfat grupları da gümüş boyamada işe karışabilmektedir. Gümüşe bağlanan nükleolin (C23) ve B23 iki majör AgNOR proteinleridir. C23 ve B23 çekirdekçiğin fosforile edilen ana asidik fosfoproteinleridir. Bu proteinlerin küçük birimleri olan fosfoserin ve fosfotrionin gümüş boyamada işe karışabilmektedir. Bunun yanı sıra nükleolinin amino terminal bölgesindeki asidik amino asitlerin konsantrasyonu, gümüş iyonlarının indirgenmesinden sorumludur.
İnsanlarda Çekirdekçik Nükleolus Yapısı
Hücre çekirdeği içinde rRNA sentezinden sorumlu bölgeler olan çekirdekçikler, ökaryotik hücrelerin ribozom üreten merkezleridir. rRNA öncül moleküllerinin sentezlediği ve işlendiği yer olmasının yanısıra, rRNA öncül molekülleri burada spesifik ribozomal ve non-ribozomal proteinlerle düzenli olarak birleşerek preribozomları oluştururlar. Neticede, hemen hemen olgunlaşan ribozomal alt birimler, çekirdekçikten serbest bırakılır ve nükleer por komplekslerinden geçerek protein biosentezinde önemli rol oynadıkları sitoplazma içinde taşınırlar. Sitoplazmaya ribozomal partiküllerin taşınmasını kolaylaştırmak için çoğu ileri ökaryotik hücre tiplerinde çekirdekçik, nükleer zarın yakınına yerleşmiştir.
Çekirdekçiğin durumuna bakılarak, kromatin organizasyonu ve transkripsiyonu arasındaki ilişkiler açıklanabilir. Aynı zamanda çekirdekçik, sitoplazmik yapıların farklılaşmasını düzenlemede de rol oynar.
Çekirdekçik, ileri ökaryotik hücre döngüsü boyunca geniş ölçüde yapısal değişikliklere uğrar. Profazda parçalanır ve iki kardeş hücrenin yeniden şekillenen çekirdeğinde tekrar ortaya çıkar.
Bazı faktörlere bağlı olarak bir hücrede çekirdekçik sayısı değişebilir.
Bir hücrede en fazla gözlenebilen çekirdekçik sayısı, en çok bu hücredeki aktif (rRNA sentezleyen) NORs (nucleolus organizing regions) sayısı kadar olabilir. Bir NOR, belli bir kromozom üstünde yerleşik rDNA bölgesidir.
Hücrenin fizyolojik durumuna bağlı olarak çekirdekçiğin sayısı değişebilir. Uzun süreli interfazda aktif NOR’ların birleşmesi sonucu çekirdekçik sayısı azalabilir ya da önceden inaktif olan NOR’ların etkinleşmesi sonucu artabilir.
Sık sık meydana gelen mitotik bölünmelerden dolayı çekirdekiçik sayısı artabilir.
Çekirdekçiğin yapısı dıştan içe doğru üç bölümden oluşur:
Granüllü Bölge (Granular Component, GC)
Granüllü bölge, rRNA transkriptlerinin olgun bir biçimde hazırlandığı bölgedir. Ribonükleer protein partiküllerini içeren çekirdekçiğin en dış çevresindeki bölümüdür.
Yoğun İpliksi Bölge (Dense Fibrillar Component, DFC)
Yoğun ipliksi bölge, RNA sentez bölgesidir. DNA ve RNA’nın yanı sıra, gümüşle boyanabilen proteinleri içeren yoğun boyanan bölgedir. Yoğun ipliksi bölge bazen, ipliksi merkez içine çıkıntılarla intranükleolar bir retikulum oluşturabilir. Yoğun ipliksi bölgeler, yüksek yoğunluklarda ribonükleoproteinleri içerir.
İpliksi Merkez (Fibrillar Center, FC, Core Structure)
Çekirdekçiğin en iç bölgesi olan ipliksi merkez açık boyanan transkripsiyon bölgesidir. DNA, RNAP I ve diğer proteinleri içerir. Elektron mikroskobu görünümü, genellikle dairesel şekildedir ve çok az RNA içerir. Elektron mikroskobunda görülen interfaz çekirdeğinde, gümüş granüllerin çökelmesi en fazla çekirdekçiğin ipliksi merkezi üzerinde meydana geldiği ileri sürülmektedir. rRNA transkripsiyonunun yapıldığı bölge son zamanlarda hala tartışmalı durumdadır. Çekirdekçiğin ayrıntılı yapısının bilinmesine karşın moleküler yerleşimlerinin açıklanması henüz net değildir.
Ribozom Nedir
Ökaryot ribozomları, 40S ve 60S’lik iki alt birimden oluşur. Hücre içindeki sayıları, hücrenin protein sentezleme hızına ve dokudan dokuya değişir.
60S’lik alt birim ; 28S, 5.8S ve 5S rRNA ile yaklaşık 45 çeşit proteinden oluşmuştur. 40S’lik alt birim ise 18S’lik bir rRNA ile yaklaşık 30 çeşit proteinden oluşmuştur
Kromatin Nedir
DNA çift sarmalların histon ve histon olmayan proteinlerle yapılanması sonucu ökaryotlarda oluşan yapılara kromatin denir. Sonuçta kromatin DNA, histonlar, histon olmayan proteinler ve RNA’dan oluşur.
Nükleozom yapısı DNA’nın histonlarla oluşturduğu yapıdır. Bir nüklezom, histonlar üzerinde DNA çift sarmalının sola dönümlü olarak iki tur yapıp, diğer histon yumağına uzandığı birimdir. Kromatinin rRNA sentezleyen yani aktif bölgelerinde nükleozomik yapı bozulur.
Kromatin maddesi hematoksilen ve bazik boyalarla boyanan preparatlarda (dinlenme halindeki bir hücrede) iplikçikler ve taneciklerden oluşmuş bir ağ görünümündedir. Boyalı preparatlarda tanecikli kısımlar koyu, ipliksi kısımlar ise açık renkte görünür. Tanecikli kısımların koyu görünmesinin nedeni, taneciklerin çekirdek içinde yer yer biraraya toplanarak değişik şekil ve büyüklükte topluluklar yapmasıdır.
Kromatin yoğunlaşma derecesine, sonuçta boyanma şiddetine göre heterokromatin (condensed chromatin) ve ökromatin (dispersed chromatin) olmak üzere ikiye ayrılır
Heterokromatin (condensed chromatin); kromatinin interfazda transkripsiyon yapmayan yani inaktif bölgeleri elektron mikroskopta koyuca boyanmış sıkıca paketlenmiş olarak görünürler. Çok sayıdaki kromatin fibrillerinin birbiriyle sıkıca paketlenmesiyle oluşan bu koyu bölgedeki kromatine heterokromatin denmektedir
Heterokromatin bölgeler, uyarılmamış nükleus (çekirdek) da tüm nükleer hacminin yaklaşık yarısını oluşturur.
Ökromatin (dispersed chromatin); kromatinin transkripsiyon yapan yani aktif bölgeleri olup açık boyanırlar. Bu bölgeler interkromatin bölgeler ya da nükleoplazma olarak da tarif edilebilirler. Kromatin fibrilleri ökromatin bölgede yakın birleşme göstermezler. Bu materyal çekirdekte nispeten dağılmış görünüşte olup, çoğu ökaryotik hücrelerde nükleer bölgenin çoğunu oluşturur. Kromatin maddesinin çekirdek içindeki dağılımı hücreden hücreye farklılık gösterir.
Memelilerde ökromatin bölgelerin replikasyonlarının heterokromatin bölgelerinden daha önce yapıldığı bilinmektedir. Aktif genler ökromatin içlerinde bulunurlar. Genetik materyalin yoğunlaşması, aktivitesi ile ilgilidir. Ökromatin içinde yer almak trankripsiyon için zorunlu ama yeterli değildir; çünkü ökromatin içindeki sekansların sadece çok küçük bir kısmı sürekli transkripsiyon gösterir.
Heterokromatinin sitolojik ve moleküler yapısı ökromatinden fonksiyonel olarak farklıdır.
Trombosit Fonksiyonları
Trombositler adezyon ve aktivasyonu takiben sekresyon ve agregasyon özellikleriyle fonksiyon görürler. Travma ile damar hasarı sonucu oluşan vazokonstrüksiyon, kan akımının yavaşlamasına neden olur. Trombositler hasarlı bölgeyi reseptörleriyle tanırlar ve endotele yapışırlar. Adezyon ve agregasyonu takiben trombositlerden salınan maddeler hem koagülasyonda hem de inflamasyonda yer alan maddelerdir. Serotonin, ADP, Kalsiyum(Ca), fibrinojen, PF4, βTG, Faktör V bu süreçte salgılanan bileşiklerden bazılarıdır.
Adezyon ve Aktivasyon
Tromboplastin, kollajen ve epinefrin (adrenalin) gibi doku hasarı sonucu ortaya çıkan agregan maddeler aracılığı ile aktive olan trombositler, hasarlı yüzeye membranlarındaki glikoprotein reseptörleri aracılığı ile yapışmayı(adezyon) gerçekleştirirler
Şekil değişikliği ile birlikte trombosit membranındaki GpIIb/IIIa sayısı artar ve P selektinin yüzeye göç etmesi ile birlikte trombosit yapışma özelliği kazanır. Aktivasyon sürecinde trombosit granüllerindeki Ca, ADP, seratonin gibi kemoatraktan ve agregan maddeler vasıtası ile trombosit ve lökosit göçü sağlanır. Aktivasyon süreci, hasarlı bölgede tıkaç oluşumuna kadar devam eder.
Trombosit aktivasyonu sonucu ortaya çıkan önemli değişiklikler
1) Trombosit glikoproteinlerinin yeniden yapılanması,
2) Reseptörlerin moleküler konformasyonlarında değişiklikler,
3) Granül içeriklerinin salgılanması,
4) Trombosit kaynaklı mikropartiküllerin oluşumu,
5) Lökosit-trombosit kompleksleri (Lökosit-trombosit agregatları), oluşumudur.
Trombosit fonksiyonlarının değerlendirilmesinde kanama zamanı, agregasyon çalışmaları, trombosit fonksiyon analizörleri, serum veya idrarda trombositlerin aktivasyonları ile ortaya çıkan ürünlerin ölçümü gibi klasik yöntemler günümüzde de kullanılmaktadır. Akan hücre ölçer kullanılan (Flow Cytometric) yöntemler, önemli avantajlarlara sahiptirler. Örneğin agregometre ile yapılan trombosit agregasyon çalışmalarında trombositlerin reaktivitesi (agonistlere olan agregasyon cevabı) değerlendirilebilirken, akan hücre ölçer ile trombositlerin reaktivitesi yanında istirahat halindeki aktivasyon durumları da değerlendirilebilmektedir
