Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR, spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmsi olup invitro bir yöntemdir. Yöntem 1980’li yıllarda Cetus firması çalışanları tarafından geliştirilmişl olup, o günden bu güne kadar pek çok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır; Klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması, ve pek çok hastalığın DNA temeline dauyalı tanısını koymada. PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA parçalarının sentezi 1-2 saat içinde yapılabilmektedir. Tüm bu sebepler PCR tekniğinin moleküler tıpta yaygın kullanılmasına neden olmuştur.
Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli DNA molekülünden hedef dizilere iki oligonükleotit primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler , kalıp DNA molekülü yüksek sıçaklıkta denatüre edildikten sonra tek iplikli DNA molekülü üzerine uygun sıcaklıkta kendileri için kalıp olan bölgeye hibridize olurlar. Bu işlem düşük sıcaklıkta gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid (dNTP) varlığında primerlerin serbest 3’ hidroksil uçlarına kalıp diziye uygun olan bazları bağlar. Böylece kalıp ipliğe tamalayıcı yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsünde denatürasyon, primerlerin bağlanması (annealing) ve uzama (extension) olarak adlandırılan başlıca üç aşama vardır. Ardışık tekrarlar ile hedef DNA bölgesi istenilen miktarda çoğaltılabilir. Reaksiyonu gerçekleşmesi için ortamda bulunması gereken moleküller ve enzimleri şu şekilde sıralayabiliriz:
1. Kalıp DNA
2. DNA polimeraz enzimi
3. Primerler
4. Dört çeşit dNTP
5. MgCl2
6. Tampon
PCR Çeşitleri
Moleküler çalışmalarda kullanılan amaca yönelik birden fazla PCR çeşidi bulunmaktadır. Çalışılan DNA kaynağına ve hedef DNA bölgesine göre faklı yöntemler tercih edilebilir. Temelde ayni mekanizma kullanılmakla birlikte birbirlerinden faklılıuklraı bulunmaktadır. Bunların listesini vercek olursak;
1. Nested PCR (Yuvalanmış PCR)
2. Anchored PCR (Demirlenmiş PCR)
3. Revers Transkripsiyon PCR (RT-PCR, Geri PCR)
4. Asimetrik PCR
5. Inverse PCR (IPCR, Ters PCR)
6. In situ PCR
7. Multiplex PCR (Çoklu PCR)8. Rastgele Çoğaltılmış
Kaydol:
Kayıtlar (Atom)
