BCR ve ABL Geninin Yapısı
ABL geninin yapısı ve proteininin fonksiyonu
ABL geninin ekspresyonu sonucu moleküler kütlesi 145-kd ve 9q34'de yerleşik olan, 11 ekzona sahip ve 230 kilobaz uzunluğunda ABL proteini oluşur. ABL proteinleri nonreseptör tirozin kinazlar olup sinyal iletimi ve hücre büyümesinin düzenlenmesinde önemli role sahiptirler (12). ABL genindeki kırılma noktası genellikle ekzon 2'nin 5' (sentromere doğru) ucunu içermektedir. ABL ekzon 2 ve 11 (a2-all) BCR geninin ekzon 2 ve 16 (bl-b5) arasındaki kınlma bölgesine (majör breakpoint cluster region; M-bcr) yerleşir (12). Sonuçta, gerçekleşen gen füzyonu ile BCR-ABL kimerik geni ve bu genin kodladığı kimerik proteinler olan pl90/BCR-ABL, p210/BCR-ABL, p230/BCR-ABL proteinleri (190, 210 ve 230 kd) oluşur (12). BCR-ABL füzyon geni tarafından kontrol edilen kötü huylu transformasyon mekanizmaları, ABL tirozin kinaz aktivitesinin kontrolünde; BCR/ABL pozitif hücrelerin biyolojik özellikleri ve aktif sinyal ileti yollarında; bozulmuş adhezyon özelliklerinde; mitoz sinyal ileti yollarının aktivasyonunda Ras ve MAP Kinaz yolakları, JAK/STAT yolağı, PI-3 Kinaz yolağı ve Myc yolağı gibi; Apoptozun engellenmesinde ve ABL Gen aktivitesini engelleyen proteinlerin parçalanmasında rol oynamaktadır (13). ABL'ın tirozin kinaz işlevini düzenleyen, ABL'ın N-uç kısmı üç SRC homoloji bölgelerine ( SH1, SH2 ve SH3 ) sahiptir.
Bu bölgeler içinde SH1 bölgesi oldukça önemli olup tirozin kinaz akti vitesi gösterir. SH2 işlevinin tamamının eksikliğinde fosfotirozin bağlanmasında azalma ve ABL'ın transforme kapasitesinde düşüş görülür. SH3, tirozin kinaz fonksiyonu üzerinde negatif düzenleyici etkiye sahiptir (12,13). Normal ABL proteini hücre siklusunun düzenlenmesine, genotoksik strese karşı hücresel cevaba ve integrin sinyalizasyonu aracılığıyla hücresel çevre hakkında bilgi iletilmesine karışır. ABL proteini hücresel ölçü birimi gibi karmaşık rol sağlayarak çeşitli hücre dışı ve hücre içi kaynaklardan sinyalleri bir bütün olarak toplar ve hücre siklusu ve apoptozise gelince kararları etkiler (12). Hücre siklusunun Gl fazında yer alan hücrelerdeki c-ABL (cellular-hücresel ABL)'in nükleer havuzunun bir kısmı Retinoblastoma (Rb) proteini ile karmaşık haldedir
BCR geninin yapısı ve proteini
BCR geninin ürünü olan ve her yerde ekspresyonu yapılan 160-kd ağırlığındaki proteinde birkaç yapısal motif betimlenmiştir (15). İlk N-terminal ekzon serin-treonin kinazı kodlar. Sadece bu kinazın substratları proteinlerin 14-3-3 ailesinin üyesi olan Bap-1 ve belki BCR'ın kendisidir. BCR'ın N-terminal bölgesinde 'coiled-coil' bölgesi in vivo ortamda dimerizasyona (Dimerizasyon Bölgesi) olanak sağlar. Molekülün merkezi dbl benzeri ve pleckstrin-homoloji (PH) bölgelerini içerir. PH bölgesi, Rho guanidin exchange faktörleri üzerindeki guanidin trifosfat (GTP)'ın guanidin difosfat (GDP)' e dönüşümünü uyarır (15). Rho guanidin exchange faktörleri NFKB gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonunu sağlayabilir. PH bölgesinden sonra kalsiyum bağımlı lipid bağlanma bölgesi (CaLB) yer alır. C-terminal bölgesi Rac için GTPase aktivitesine sahiptir ve Rac guanozin trifosfat-aktivatör protein ( Rac-GAP) bölgesi olarak geçer. Ras süper ailesinin küçük GTPase'ı aktin polimerizasyonunu ve fagositik hücrelerde NADPH oxidase aktivitesinin düzenleyicisidir. BCR birkaç tirozin rezidüsü üzerinden özellikle tirozin 177 (Y177) üzerinden fosforlanabilir (15). Y177, Ras yolağının aktivasyonuna karışan önemli adaptör molekül olan growth factor receptor-bound protein 2 (Grb- 2)'e bağlanır. ABL'ın COS1 hücrelerinde BCR'ı fosforile ettiği bunun sonucunda BCR kinaz aktivitesinin düştüğü gösterilmistir
Kortaktin (EMSİ) Nedir
EMSİ geni, bir onkogen olup insan 11. kromozomunun q kolunda yer almaktadır (llql3) (31). Hücre yapısının düzenlenmesine katkıda bulunan bu gen 550 aa içerir ve hücrede sitoplazma ya da hücre iskeletinde bulunur. Kortaktinin en önemli görevi; karsinoma hücreleri ve epitelyumda hücre iskeleti ve hücre adhezyon yapısını düzenlemektir. Apoptozis esnasında, kaspaz bağlı yapıların protein kodlamasını engeller ya da azaltır. Ayrıca, transforme olmuş hücrelerin tirozin fosforilizasyonunda, hücresel büyümenin düzenlenmesi ve transformasyonuna da katkıda bulunur. Bu genin amplifikasyonu göğüs kanseri, ense ve kafada bulunan hücre karsinomlannda sıklıkla rastlanabilir. Bu bölgede amplifiye olduğu bilinen onkogenler INT2 ve FGF4'tür. EMSİ'in p80 ve p85 olarak tanımlanan 2 formu bulunur. Bu karsinomlarda p85'in p80'den post translasyonel modifikasyonla türediği bulunmuştur. Ayrıca potasyum kanallarında EMSİ'in önemli rolleri olduğu bildirilmiştir
Murine Double Minutes (MDM2)
MDM2 geni 12ql3-14 kromozom bölgesinde yerleşmiştir (34). Buradan kodlanan MDM2 proteini (pMDM2), p53'ü kontrol altında tutar ve p53'ün Gl/S geçişinde siklusu durdurma ve apoptoz etkisini engeller (61). MDM2 proteini sitoplazmada p53' e bağlanarak, "E3 ubiquitin lıgase" aktivitesi ile p53'ü yıkar yani p53'e karşı çalışan bir proteindir. Hipoksi, ultraviyole, radyasyon gibi hücrenin strese maruz kaldığı durumlarda pMDM2'nin p53'e bağlanma yerinde asetilasyon ve fosforilasyon nedeniyle yapısal değişiklik oluşur. Bu yüzden MDM2 proteini p53'ü bağlayamaz ve serbest kalan p53 transkripsiyonel aktivitesini göstererek Gl ve G2 kontrol noktalarında siklusun durdurulması ve BAX geni aktivasyonu ile apoptoza neden olur. Ancak özellikle onkojenik stimulus varlığında pMDM2 etkisini, p53'e bağımlı olmayan yolla gösterir. Gl/S geçişinden sorumlu olan E2F/DP1 aktivasyonunu pl4ARF'in inaktivasyonunu yapar. İnaktive olan pl4ARF hücre çekirdeğinde pMDM2'yi bağlayamaz ve sitoplazmaya çıkmasına engel olamaz. Bu nedenle P53'ün etkisi azalır. Ayrıca E2F aktivasyonu yaptığından hücre Gl fazından S fazına geçer. MDM2 genindeki amplifikasyon glioblastomlarda < %10'un altında bulunmuştur
Immünohistokimyasal çalışmalarda pMDM2'inin aşırı ekspresyonu primer glioblastomda %52, sekonder glioblastomda %11 bulunmuştur. MDM2'in aşırı ekspresyonu, MDM2 geninin amplifikasyonu ve p53 mutasyonu bulunmayan primer glioblastomlarda saptanmıştır. Ayrıca kromozom 12q22-23 bölgesindeki LOH glioblastomlarda %42 düzeyine kadar ulaşmaktadır. Bu bölge "apoptotic proease activating factör-1" (Apaf-l)'i içermektedir. Bu bölgede olan kayıplar nedeniyle Apaf-l'in fonksiyon görmemesi sonucunda p53'ün neden olduğu apoptoz yolunun sonlanması ile glioma onkogenezi başlamaktadır. Kromozom 12q 22-23 bölgesindeki LOH'nin, p53 gen mutasyonu ve EGFR gen amplifikasyunu ile beraber olmaması, astrositik öncü hücrelerinin de novo olarak direkt malign transformasyonunla primer glioblastom gelişiminden sorumlu tutulmaktadır
Meme Kanseri Tip 1 (BRCAl) ve Meme Kanseri Tip 2 (BRCA2)
İnsan 17. kromozomun q kolunda BRCAl geni ve 13. kromozomun q kolunda BRCA2 geni bulunmaktadır (BRCAl; 17q221, BRCA2; 13ql2.3) (31). BRCAl geni 1863 aa, BRCA2 geni ise 3418 aa'lik bir proteini kodlar. Her iki protein de hücrenin diğer bazı proteinleri ile bağlanarak işlev görür (31). Hücre proliferasyonunun kontrolünde, BRCAl ve BRCA2 proteinlerinin tümör baskılayıcı proteinler ile DNA hasarına ve tamirine katılan proteinler ile transkripsiyonun düzenlenmesinde rol alan proteinler ile hücre siklusunun kontrol noktalarının önemli proteinleri ve DNA'da rekombinasyonda iş gören proteinler ile yakın ilişkileri gösterilmiştir (69). BRCAl ve BRCA2'deki mutasyonlar; BRCA proteinlerinin inaktivasyonu, tümör baskılayıcı proteinlerin ve diğer "genom koruyucu" rolü olan proteinlerinde inaktivasyonuna neden olarak hücreyi tümör oluşumuna götürürler.
Bugüne kadar yapılan çalışmalar ile BRCAl ve BRCA2 genlerinde 1000'den fazla birbirinden farklı DNA dizi değişikliğine dayanan mutasyonlar tespit edilmiştir. Çeşitli mutasyon tiplerine rağmen BRCAl ve BRCA2 genlerindeki germ soyu mutasyonların büyük bir çoğunluğu tek tiptir. Bu mutasyonların topluma ve etnik gruba özel olduğu da gösterilmiştir. Örneğin Ashkenazi yahudilerde üç tane ortak BRCA l/BRCA2 atasal mutasyonları vardır.
Bunlar BRCAl'deki 185delAG ve 5382insC mutasyonları, BRCA2'deki 6174delT mutasyonudur (70). Türk toplumunda yapılan çalışmalarda meme veya ovaryum kanserli hastalarda yapılan BRCAl ve BRCA2 genlerine ait mutasyon taramalarında, Türk toplumuna özgü sayılacak tekrarlayan bir mutasyon bildirilmemiştir. Meme ile birlikte ovaryum kanserine yatkınlık geni taşıyan ailelerde BRCAl ile %80'e yakın ilişki vardır, meme kanserli ailelerde BRCAl için bu oran %45 ve BRCA2 için %35' dir. Büyük ölçekli çalışmalarda, ailesinde 60 yaşından önce meme kanseri teşhisi konan en az dört kadın bireyin veya herhangi bir yaşta meme kanserli erkek bireyin olduğu ailelerde BRCAl (%52) ve BRCA2 (%32) mutant allellerinin meme kanseri ile yakın ilişkisi gösterilmiştir (71,73). Meme dokusunda alveoler ve duktal epitel hücrelerinde BRCAl'in ekspresyonu gözlenir (72). Bu gen hamilelik ve emzirme dönemlerinde belirgin olarak aktif çalışırken, parturisyonda laktasyon sonrası ekspresyonu azalır (72). BRCAl mutasyonuna sahip kadınlarda pubertedan sonra meme veya ovaryum tümörlerinin gelişme riski %5-10 kat artar. BRCAl steroide bağımlı bir hücre döngüsü düzenleyicisi olarak işlev görüyor olabilir.
Gerçektende BRCA1 ve BRCA2 genleri insan meme kanseri hücrelerinde östrojene duyarlıdır ve cevap olarakta her iki gene ait m-RNA seviyeleri artar. BRCA1 geninin bir allelindeki mutasyon erken dönem dişi meme kanserlerinde yüksek risk oluşturur, buna karşılık kolon ve prostatta daha düşük bir risk taşır. BRCA2 genindeki mutasyonlar ise erken dönem erkek meme kanserlerinde yüksek bir risk taşır
Retinoblastoma 1 (RB1)
İnsan 13. kromozomunun q kolu üzerinde yerleşmiş olan RB1 geni 27 ekzondan oluşmaktadır (31). Bu gen 4.8 kb'lik bir mRNA üretir. Bu mRNA, 928 aa bir protein olan pRB' ye aracılık eder (31). pRB de paket protein ailesinden olup 105 kb' lik bir nükleer proteindir. Aynı zamanda RB1, N terminal bölgesinde santral A, B domainleri ile C terminal domain olmak üzere üç farklı domain ihtiva eder. Bu üç domaninin ana fonksiyonları; büyümenin düzenlenmesi, hücre farklılaşması, viral ve selüler proteinlerin interaksiyonu ve transkripsiyonel regulasyondur. pRB biyolojik etkisini transkripsiyonu seviyesinde hem pozitif hem de negatif regulasyonla düzenler. Pozitif gen regülasyonu hücrelerin farklılaşması ile bağlantılıdır (31). Transkripsiyon seviyesinde baskılama hücre döngüsünün inhibisyonuna yol açar. pRB, transkripsiyonu çeşitli mekanizmalarla baskılar
RB1 geninin RB proteini, çekirdekte yer almaktadır ve dinlenme fazındaki (Go veya Gı) hücrelerinde fosforile olmamış haldedir. PRB, siklin D-cdk4/t ve siklin E-cdk tarafından fosforile olur. Erken Gı fazında hipofosforile olmuş pRB, M fazında yeniden ortaya çıkar. Hipofosforile olmuş pRB, Gı fazında hedef proteinlere bağlanır ve siklüs durur. PRB'nin hiperfosforile formu yani serin ve treonin bölgesinden fosforile olmuş formu ise geç Gı fazı dahil S, G2 ve M fazlarında mevcuttur. PRB'nin fosforile olmasının Gı fazındaki duraklamayı ortadan kaldırdığı sanılmaktadır. Çünkü fosforile olmuş pRB, ilişkili olduğu E2F2 ve HDACs ile artık interaksiyona giremez ve DNA sentezinin S fazında gerekli gen transkripsiyonunu aktive eder. Bu esnada yine E2F siklin E ve A expresyonunu artırarak pRb'nin fosforilasyonunu tamamlamasını sağlar. SV40 T gen antijeni, Go/Gı fazında fosforile olmuş RB proteinine (pllO) bağlanmaktadır. Böylece dominant olmayan transforme eleman olarak SV40 T'nin RB proteinine bağlanarak; Go/Gı fazını büyüme baskılayıcı etkisiyle düzenleneceği ve inhibe edeceği öne sürülmüştür. Transforme olmamış ebeveyn hücreleri, sadece pl 10 RB proteini mevcut olduğunda Go fazına girmektedir. Teorik olarak; SV40 T'nin bu etkiyi pllO RB1 proteinine bağlanarak engellediği bilinmektedir. Bu proteinin yüksek bir afinite ile DNA'ya bağlanması en önemli fonksiyonudur. Böylece RB1 proteini, gen düzenleyici bir fonksiyona da sahip olmaktadır. Sonuç olarak, hücre suçlusunda Gı'den S fazına geçişi, RB1 proteini kontrol etmektedir. Bu gen hücresel diferansiyasyonda çok önemli bir role sahiptir. RB 1 gen inaktivasyonu özellikle retinoblastoma ve osteosarkom tümör hücrelerinde gösterilmiştir. Mutasyon veya delesyonlara bağlı olarak inaktive oldukları diğer maligniteler arasında özefagus ve meme kanserleri sayılabilir
B Hücreli Lenfoma-2 (BCL2)
BCL2, insan 18. kromozomunun q kolunda yer almaktadır (18q21.3) (31). BCL2 proteini mitokondrinin hem iç hem de dış membranında lokalize olduğu gibi endoplazmik retikulumda (ER) nukleus membranı periferinde ve sitoplazmada az miktarda bulunabilir, genellikle membran yapıları ile işbirliği halindedir (31). Büyüme faktörü bağımlı hücre dizileri ile yapılan çalışmalarda BCL2 proteinin proliferasyon uyarımı olmaksızın hücrenin yaşamını sürdürmesini sağladığı belirlenmiştir. BCL2'nin reaktif oksijen türlerini direk inaktive ettiği veya bunların oluşumunu engellediği, ER'da Ca+2 geçişini düzenlediği ve nükleusda nüklear por kompleksi ile bağlantılı ve nüklear transportdan sorumlu olduğu sanılmaktadır
BCL2 ailesi birbirine zıt etkileri olan iki gruptan oluşur. Bu gruplardan biri pro-apoptotik (apoptozisi indükleyici) diğeri ise anti-apoptotik (apoptozisi baskılayıcı) etkidir. Pro-apoptotik olanlar, sitokrom C'nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesini uyarırlar. Anti-apoptotikler ise; sitokrom C salıverilmesini baskılarlar. Bu iki zıt etkili grubun işleyişi yapılarında bulunan iki bölgeye (hidrofobik cep BH1, BH2 ile BH3 ve amfipatik a-heliks) bağlıdır. Pro-apoptotik üyeler kendi içinde iki alt gruba ayrılırlar. Bu alt grublardan biri yapılarında her üç bölgeyi (BH1, BH2, BH3) de içeren üyelerden (örn. BAX, BAK), diğeri ise sadece BH3 bölgesini içeren üyelerden (BID, BAD, BIM) oluşur. Anti-apoptotik üyelerde ayrıca BH4 bölgesi bulunur. Bu bölgenin, apoptozisin diğer hücresel yollarla ilişki kurduğu düşünülmektedir. Anti-apoptotik üyeler, doğal olarak "içsel" sitokrom C'nin salıverilmesini baskılama özelliğine sahiptir. Bu durumda, pro-apoptotik üyelerin anti-apoptotik üyelerle bağlanması halinde bu inhibitör etki ortadan kalkar ve sitokrom C salıverilmesi gerçekleşir. Bu yüzden, pro ve anti-apoptotik üyelerin dengesi yaşam ile ölüm arasındaki seçeneği belirler. Anti-apoptotik üyelerin aşırı ekspresyonlarının apoptozisi baskıladığı oysa pro-apoptotik üyelerin aşırı ekspresyonunun ise hücreleri öldürdüğü görülmektedir. Anti-apoptotik BCL2 ailesi üyelerinin en iyi bilinenleri: BCL2, BCL-X1, MCL-1 iken, pro-apoptotik olanları ise: BAX, BCL-Xs, BAD, BIM, BAK, BID'dir.
Nitrik Oksid Sentaz (NOS)
Nitrik oksit (NO), 1979'da siklik guanozin monofosfat (cGMP) üzerinden etki gösteren potent bir periferik vasküler düz kas gevşetici olarak tanımlanmıştır (3). NO, hücre içi ve hücre dışında düzenleyici işlev gören küçük, reaktif bir serbest radikal moleküldür (3). Birçok hücresel işlem; endotel, trombosit, vasküler düz kas hücreleri, nöronlar ve diğer NO üreten hücrelerden salınan NO tarafından düzenlenmekte ve birçok dokuda sentezlenmektedir. NO, endojen L-argininden NOS enzim sistemi tarafından sentezlenir ve işlev sonrasında hızlı ve kararlı bir şekilde okside edilerek inaktif bileşikler olan nitrit ve nitrat gibi son ürünlere dönüşür. Hemoglobin NO'yu inaktive eder. NO'nun en önemli fizyolojik hedefi, çözünebilir guanilat siklaz (sGC) enziminin hem grubudur. Düz kas hücresine geçen NO, guanilat siklazı uyararak, guanozin trifosfatın cGMP'ye dönüşümünü sağlar. Artan cGMP de protein kinazı ve iyon kanallarını aktif hale getirir. Sekestrasyon ve hücre dışına çıkarılma yolu ile hücre içi kalsiyum azalır ve gevşeme sağlanır. cGMP'nin fizyolojik etkisi 3'5' bağının fosfodiesteraz enzimi tarafından hidrolize edilmesi ile sonlandınlır. NOS'un nöronal (nNOS veya NOS-1), indüklenebilir (İNOS veya NOS-2), endotelyal (eNOS veya NOS-3) olmak üzere 3 farklı formu vardır. Endotelyal ve nöronal sürekli bulunan, İNOS ise uyarıma bağlı olarak yapılan NOS'tur
Vücutta NO konsantrasyonu düzenli olarak düşük seviyelerdedir ve eNOS ve nNOS tarafından kontrol edilir (113). Bu iki enzimin sentezi posttranskripsiyonel seviyede kontrol edilirken, İNOS uygun uyarı veya NFKB gibi transkripsiyonel faktörlere cevap olarak sentezlenir. Bu sentezi tetikleyen, NFKB'ye yanıt veren elemanların İNOS promotor gen bölgesini aktive etmesidir. Enfeksiyon, enflamasyon veya vasküler travma durumlarında diğer iki NOS formunun ürettiğinin 100-1000 katı kadar daha fazla NO üretir. Ayrıca İNOS, kalsiyum ve uyarıcı ajanlardan bağımsız çalıştığı için, aktivitesi daha uzundur. Bunlara bağlı olarak, iNOS'un ürettiği NO seviyesi, fizyolojik sınırların üstündedir. Bu durum, hücresel süperoksit anyon (02") varlığında ileri derecede toksik olan peroksinitrit molekülünün oluşmasına neden olur. Bunun sonucunda da lipid peroksidasyonu, DNA fragmantasyonu, plazma antioksidanlannın azalması, protein hasarı ve endotelyal düz kas gevşemesinin engellenmesi gibi nedenlerle hücresel hasar oluşabilir. Peroksinitrit oluşumu; süperoksit ile süperoksit dismutaz (SOD) üretimi ve NO üretimi/harcanması arasındaki dengeye bağlıdır. Sonuç olarak, düşük konsantrasyondaki NO, hücresel fonksiyonları pozitif olarak düzenlerken, yüksek konsantrasyonlarda hücre üzerinde toksik etkiler yaratabilir
