Genomik DNA Hasarlarının Gösterilmesinde Kullanılan Metodlar
Mikronükleus Testi
Mikronükleus testi, in vitro ve in vivo olarak etki eden endojen ve eksojen ajanların etkilerinin gösterilmesinde kullanılan hassas bir yöntemdir (70). Mikronükleuslar (MN) hücrede mitoz bölünme sırasında ortaya çıkan, ana çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom parçalarından köken alan oluşumlardır.
MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Anöploidiyi uyaran ajanlar, sentromer bölünme hatalarına ve iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol açarak; klastojenler ise kromozom kırıkları oluşturarak MN oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar.
MN testi, küf mantarlarının metabolitlerinden biri olan Sitokalasin-B (Cyt-B) ile mitoz geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına dayanmaktadır (28). Standart lenfosit kültürlerine uygun konsantrasyonda Cyt-B ilavesiyle, ilk nükleus bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş binükleuslu (BN) hücreler kolaylıkla tanınarak sayılabilmekte ve MN bulunduran hücrelerin oranı saptanabilmektedir.
Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda reaktif oksijen metabolitlerinin de DNA’da mutajenik etkilere neden olduğu veya ploidi gibi kromozomal sayı anomalilerine ve mikronükleus (MN) oluşumuna yol açtığı iyi bilinmektedir
Alkalin Tek Hücre Jel Elektroforezi ( Komet Asay)
Komet asay veya tek hücre jel elektroforezi, DNA hasarlarının ölçüldüğü hızlı, hassas ve basit bir floresan mikroskobik metod olup, insan popülasyonlarındaki DNA hasarını ölçmek için kullanılmaktadır.
Bu yöntem, hücresel düzeyde DNA kırıklarının ölçümünü sağlamaktadır. Kırılmış DNA içeren hücrenin kuyruklu yıldıza benzeyen görünümü nedeniyle bu teknik “KOMET” adını almıştır. Floresan boyanmış bir baş ve kuyruk görüntüsünde, floresanla boyanma yoğunluğu DNA ipliğindeki kırıklarla orantılıdır
Komet asay, DNA kırıklarını ölçme de hassas olmasının yanında; spesifik endonükleaz lezyonlarının tanımı, UV’ye uğramış pirimidin dimerlerini, oksidize olmuş bazları ve alkalizasyon hasarlarını belirlemek için de kullanılmaktadır
2Hidroksi 2’ Deoksiguanozin
Modifiye bir baz olan 8- Hidroksi 2’ Deoksiguanozin (8-OH-Dg), Guanin’in 8. karbon atomuna hidroksil radikali atakları sonucu oluşur ve oksidatif DNA hasar belirteçlerinden biridir. 8-OH-Dg, SOR’un DNA’da oluşturduğu oksidatif baz hasar ürününden en sık görülenidir. Guanin DNA bileşenleri içerisinde en düşük iyonizasyon potansiyeline sahip olduğu için SOR’un başlıca hedefi olmaktadır. 8-OH-Dg içeren zincir DNA replikasyonundan sonra mutasyonlu zincir haline geçer (80). Çünkü normalde guanin sitozin ile baz eşleşmesi yaparken, 8-OH-Dg sitozin yerine adenin ile baz eşleşmesi yapar ve GC eşleşmesi bir sonraki replikasyonda AT eşleşmesine dönüşür.
Bu özelliği nedeniyle 8-OH-Dg ölçümü, oksidatif DNA hasarını gösteren önemli parametrelerden biri olarak kabul edilmektedir
