Kardeş Kromatid Değişimi
Kardeş kromatid değişimi(KKD), DNA hasarına neden olan ajanların erken biyolojik etkilerinin belirlenmesinde en yaygın kullanılan sitogenetik markırlar arasında yer almaktadır.
KKD, homolog kromozom bölgelerindeki DNA replikasyon ürünleri arasındaki değişimdir. Bu değişimler, DNA’nın kırılıp yeniden birleşmesi ile meydana gelmektedir.
KKD yöntemi ile çok düşük konsantrasyonlarda zayıf mutajenik etki gösteren kimyasalların etkileri kromozom düzeyinde incelenebilmektedir. KKD’nin gözlemlenebilmesi için hücrelerin mutlaka iki replikasyon zamanı geçirmesi gerekmektedir
DNA ile kovalent bağlantılar yapan veya DNA tamir mekanizmalarını etkileyen maddeler genellikle KKD sıklığını arttırmaktadır. Bu maddeler DNA’ya kovalent bağlarla bağlanmakta veya DNA replikasyonunu etkilemektedirler. KKD, hasarlı DNA’nın replikasyonunun gerçekleştiği S fazında meydana gelmektedir
Replikasyon çatalında homolog çift sarmalların birbirine çok yakın oluşu ve homolog birleşmelerin kolaylıkla meydana gelebilmesinden dolayı, KKD’de kardeş kromatidler arasında gözlenen değişim noktalarının, replikasyon çatallarının bulunduğu yerler olduğu düşünülmektedir
Günümüze kadar yapılan çalışmalarda KKD analizi daha çok klastojenlerin kromozomlar üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla kullanılmıştır. KKD metodu kemoterapi alan hastaların bu süreçte maruz kaldıkları klastojenik ajanların sitolojik etkilerinin değerlendirilmesinde önem taşımaktadır. Yine klastojenik ajanlara karşı hassas olan fetal hücrelerde, bu ajanların KKD sıklığını arttığı görülmüştür. Hamilelik sırasında klastojenik ajan olan siklofosfamide maruz kalınması durumunda uterusta ve anne kemik iliğinde KKD sıklığında artış tespit edilmiştir
KKD çoğalmakta olan hücrelerde spontan olarak meydana gelir. Çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle kromozom DNA’sında meydana gelen, replikasyon sırasında onarılmayan hatalar KKD’lerinin ortaya çıkmasına ya da artmasına neden olur. Spontan olarak sağlıklı hücrelerde, DNA replikasyonunda doğal çatallanmanın bozulduğu zaman, BrdU birleşimi çok az ya da sıfır olduğu koşullarda hücre başına herbir döngü için ortalama 3-4 KKD oluşmaktadır. BrdU birleşiminin kendisi, tek zincir kırıkları ve alkali–değişken bölgelerin seviyesini arttırarak KKD oluşumuna yol açmaktadır
KKD, genotoksik olduğu bilinen veya tahmin edilen kimyasal maddelerin etkilerinin araştırılmasında kullanılan hassas bir yöntemdir. Bu nedenle deney hayvanlarında ve insan popülasyonunda bu metod kullanılarak araştırmalar yapılmaktadır
KKD sıklığındaki artış, mutajenlerin neden olduğu genetik hasarın göstergesi olarak kabul edilir. KKD çalışmalarında, mutajen-karsinojen maddelerin KKD sıklığını arttırıcı etkisi incelenmiştir. Bunun yanı sıra DNA tamir defekti ve neoplazi oluşumuna yatkınlık ile karakterize olan çeşitli kalıtsal hastalıklarda yapılan çalışmalarda KKD sıklığında artış tespit edilmiştir (45). Bunların arasında Bloom sendromu (13), Fankoni anemisi, Ataksi-telanjiektazi ve Kseroderma pigmentosum bulunmaktadır. Kromozom frajilitesine bağlı bu hastalıkların arasında benzer ajanlara karşı görülen tepki farkları, muhtemelen DNA onarım sisteminin veya DNA hasarlarına karşı tepki sisteminin altında yatan bazı defektlerin olduğunu göstermektedir (5). Ayrıca, Cockayne sendromu, Werner sendromu, Duchenne ve Becker Musküler Distrofi, Kronik myeloid lösemi (69) ve Down sendromlu hastalarda KKD sıklığının anlamlı derecede arttığı bildirilmiştir
KKD, ilk olarak otoradyografi yöntemiyle gösterilmiştir. Daha sonra BrdU kullanılan teknik gelişmiştir (50). BrdU, DNA‘ daki Timin(T) analoğu olduğu için kültür ortamında T ile yer değiştirir ve replikasyon sırasında uzayan DNA zincirine girer. Bu süreç tamamlandığında, kromatiddeki DNA ipliklerinin her ikisinin BrdU içermesi açık renk, tek bir ipliğin BrdU içermesi koyu renk boyanmasına neden olmaktadır
Kromozomal Aberasyonlar ve Kardeş Kromatid Değişimi Kromozomal Aberasyonlar
1) Sayısal Anomaliler: Kromozom sayısındaki değişiklikler, kromozom ayrılamaması veya anafazda geç kalma sonucunda ortaya çıkmaktadır (Nondisjunction ve anafaz lag)
Kromozom sayısındaki çeşitlilik, bir ya da daha fazla haploid kromozom takımının ilavesinden bir ya da daha fazla kromozom kaybına kadar değişkenlik gösterir. Bu gibi değişiklikler özel terminolojik ifadelerle temsil edilmektedir. Bunlar;
- Anöploidi (monozomi, trizomi): Hücreler tam bir kromozom takımı değil, bir ya da birden fazla kromozom kazanımı ya da kaybı şeklindedir.
- Öploidi: Bu durumda hücrelerdeki kromozom sayısı, o organizma türü için spesifik olan haploid sayının tam katları olarak artmıştır.
2) Yapısal Anomaliler: Yapısal anomalilerin nedeni, aynı ya da değişik kromozomlardaki kırılma ve yeniden düzenlenmelerdir (74). Bunlardan kromozom kırıkları; fiziksel ajanlar, virüsler ve kimyasal mutajenik ajanlar gibi ekzojenik faktörler veya DNA replikasyonu, transkripsiyon ve rekombinasyon sırasında meydana gelen ve tamir edilemeyen hataların oluşturduğu endojenik faktörler nedeniyle meydana gelebilmektedir. Endojenik ya da ekzojenik faktörlerle oluşan kromozom kırıkları yapısal kromozomal aberasyonlara neden olmaktadır
Yapısal kromozom anomalileri:
- Dengeli ( translokasyon, insersion, inversiyon) ve
- Dengesiz (delesyon, duplikasyon, izokromozom, ring) olmak üzere iki alt grupta toplanmaktadır.
Genomik DNA Hasarlarının Gösterilmesinde Kullanılan Metodlar
Mikronükleus Testi
Mikronükleus testi, in vitro ve in vivo olarak etki eden endojen ve eksojen ajanların etkilerinin gösterilmesinde kullanılan hassas bir yöntemdir (70). Mikronükleuslar (MN) hücrede mitoz bölünme sırasında ortaya çıkan, ana çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom parçalarından köken alan oluşumlardır.
MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Anöploidiyi uyaran ajanlar, sentromer bölünme hatalarına ve iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol açarak; klastojenler ise kromozom kırıkları oluşturarak MN oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar.
MN testi, küf mantarlarının metabolitlerinden biri olan Sitokalasin-B (Cyt-B) ile mitoz geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına dayanmaktadır (28). Standart lenfosit kültürlerine uygun konsantrasyonda Cyt-B ilavesiyle, ilk nükleus bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş binükleuslu (BN) hücreler kolaylıkla tanınarak sayılabilmekte ve MN bulunduran hücrelerin oranı saptanabilmektedir.
Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda reaktif oksijen metabolitlerinin de DNA’da mutajenik etkilere neden olduğu veya ploidi gibi kromozomal sayı anomalilerine ve mikronükleus (MN) oluşumuna yol açtığı iyi bilinmektedir
Alkalin Tek Hücre Jel Elektroforezi ( Komet Asay)
Komet asay veya tek hücre jel elektroforezi, DNA hasarlarının ölçüldüğü hızlı, hassas ve basit bir floresan mikroskobik metod olup, insan popülasyonlarındaki DNA hasarını ölçmek için kullanılmaktadır.
Bu yöntem, hücresel düzeyde DNA kırıklarının ölçümünü sağlamaktadır. Kırılmış DNA içeren hücrenin kuyruklu yıldıza benzeyen görünümü nedeniyle bu teknik “KOMET” adını almıştır. Floresan boyanmış bir baş ve kuyruk görüntüsünde, floresanla boyanma yoğunluğu DNA ipliğindeki kırıklarla orantılıdır
Komet asay, DNA kırıklarını ölçme de hassas olmasının yanında; spesifik endonükleaz lezyonlarının tanımı, UV’ye uğramış pirimidin dimerlerini, oksidize olmuş bazları ve alkalizasyon hasarlarını belirlemek için de kullanılmaktadır
2Hidroksi 2’ Deoksiguanozin
Modifiye bir baz olan 8- Hidroksi 2’ Deoksiguanozin (8-OH-Dg), Guanin’in 8. karbon atomuna hidroksil radikali atakları sonucu oluşur ve oksidatif DNA hasar belirteçlerinden biridir. 8-OH-Dg, SOR’un DNA’da oluşturduğu oksidatif baz hasar ürününden en sık görülenidir. Guanin DNA bileşenleri içerisinde en düşük iyonizasyon potansiyeline sahip olduğu için SOR’un başlıca hedefi olmaktadır. 8-OH-Dg içeren zincir DNA replikasyonundan sonra mutasyonlu zincir haline geçer (80). Çünkü normalde guanin sitozin ile baz eşleşmesi yaparken, 8-OH-Dg sitozin yerine adenin ile baz eşleşmesi yapar ve GC eşleşmesi bir sonraki replikasyonda AT eşleşmesine dönüşür.
Bu özelliği nedeniyle 8-OH-Dg ölçümü, oksidatif DNA hasarını gösteren önemli parametrelerden biri olarak kabul edilmektedir
