Osteoartrit Etyoloji ve Epidemiyolojisi
Etyoloji ve Epidemiyoloji
Osteoartrit (OA) insanoğlunu binlerce yıldır etkileyen bir hastalıktır. Neolitik döneme kadar varan eski tarihlere ait iskelet kalıntılarında dahi OA bulgularına rastlanmıştır. Osteoartrit insanlarla sınırlı olmayıp özellikle köpekler ve atlar olmak üzere evcil hayvanlarda da birçok probleme yol açar (3). Dejeneratif eklem hastalığı olarak da anılan OA, eklem kıkırdağında progresif kayıp ve subkondral kemikte, eklemlerin kenarlarında reaktif değişiklikler ile karakterize romatizmal bir hastalıktır
Osteoartritin ekleme etki eden bir dizi farklı etken veya hastalığın son ürünü olduğu düşünülmektedir. Bütün eklemleri etkileyebilmesine rağmen en fazla etkilenen eklemler dizler, distal interfalangeal eklemler, başparmağın kökü, kalça ve omurganın faset eklemleridir. Kalça hariç bütün eklemlerde OA, kadınlarda erkeklere oranla daha sık görülür. Kalçada oran her iki cinsiyette de aynıdır
Osteoartritin Sınıflandırılması
Halen çok iyi bir sınıflandırma sistemi olmamasına rağmen osteoartrit, çoğunlukla aşağıdaki şekilde sınıflandırılmaktadır.
• Tutulan eklem sayısı (örn. monoartiküler veya poliartiküler)
• Etiyoloji:
1. primer- saptanmış bir neden yok
2. sekonder- konjenital anomali veya travma öyküsü
• Klinik ve radyografik tablo (örn. İnflamatuar, eroziv, kristal depolanması ve diğerleri)
Osteoartritin bir dizi sık görülen tablosu vardır. En sık görülenlerden biri orta-ileri yaşta bayanlarda diz ve ellerde görülen şeklidir. Heberden nodülleri ile
karakterize nodal OA, distal interfalangeal eklemlerde (DİP) görülür ve toplumda sıklığı en yüksek OA çeşididir. Genç erkeklerde sıklıkla kalçada görülen ve çoğunlukla displazi (düzensiz büyüme) ile ilişkili olan tek eklem osteoartriti görülür. Orta yaştaki erkeklerde ise daha çok diz osteoartriti görülür. Özellikle yaşlı hasta bayanlarda başta omuzlar, dizler ve kalçalar olmak üzere çok sayıda eklemi tutan şiddetli bir formu da görülebilir. Bu hastalar önemli derecede ağrı çekebilirler ve eklemlerinde sıklıkla apatit kristalleri içeren büyük efüzyonlar gelişebilir. Bu durum eklem etrafında kemik harabiyetinin yanında yumuşak doku hasarı ve kıkırdak kaybına da yol açabilir
Osteoartrit Neden ve Nasıl Gelişir?
Belirli eklemlerde osteoartrit gelişimi ile ilgili bazı risk faktörleri bilinmektedir, ancak birçok hastalıkta olduğu gibi risk faktörlerinin olması mutlaka OA gelişmesini gerektirmez. Aksine görünürde herhangi bir risk faktörü olmayan kişilerde de hastalık oluşabilir. OA’e genetik yatkınlığı olduğu düşünülen bazı bireylerde ekleme aşırı yük binmesi gibi tetikleyici faktörler OA gelişmesine neden olabilir
Herhangi bir birey için osteoartrit gelişme riski, bireyin kişisel yatkınlığı ve lokal mekanik risk faktörlerinin çok faktörlü karışımından ibarettir. Özellikle bayanlarda nodal el osteoartritin gelişmesinde kuvvetli bir genetik etkinin söz konusu olduğu uzun yıllardır bilinmektedir. Toplumdaki “yaygın OA” için genetik etkinin varlığı ancak son zamanlarda saptanmıştır. Bu bulgu diz, kalça, omurga ve elde OA gelişiminde kuvvetli bir genetik etkinin olduğunu düşündürmektedir. Kesin genler bilinmemekle birlikte ilk planda klinikle olan ilişki çok kuvvetli bir risk faktörü olarak pozitif aile hikayesinin (anne, baba veya kardeşlerde) saptanmasıdır (2).
Osteoartritin Patofizyolojisi
Uzun yıllar boyunca osteoartrit, ilerleyen yaş ile birlikte eklem yüzeylerinin kaçınılmaz harabiyeti sonucu gelişen saf bir dejeneratif lezyon-kullanma ve aşınma hastalığı olarak kabul edildi. Fakat günümüzde, kıkırdaktaki bozulmayı rejenerasyonun izlediği dinamik bir durum olarak kabul edilmektedir. Normal eklemde hasardan çok tamir gerçekleşmektedir
Başlangıçta, eklem kıkırdağında bozulma ve yıkım olayları gerçekleşir. Proteoglikan matrikste değişiklikler sonucu, su içeriğinde ve kondrosit aktivitesinde artma neticesi ile kıkırdak fibrilasyona uğrar. Bu bölgenin darbeye karşı direnci azalır, kıkırdak yüzeyi pürüzlü ve düzensiz hale gelir. Sonra sürtünme artar ve kıkırdak büyük olasılıkla kemik yüzeye kadar yırtılır. Eklem vaskülariteyi arttırarak ve yüzeyi yeniden şekillendirerek kendisini onarmaya çalışır. Eklem bölgesinin kıkırdak ve kemik kenarlarında kondrositler ve osteofitler oluşmaya başlar. Bu eklemin artikülasyon için uygun alanı arttırma ve belki de eklem stabilitesini sağlama çabası olabilir. Eklemi çevreleyen kemikte deskleroze alanlar ve kemik kistleri gibi değişiklikler ortaya çıkar. Varolan kemiksi trabeküler yapıyı güçlendirmek için yeni kemik dokusunun oluşmasıyla skleroz ortaya çıkar. Eklem kıkırdağının olmadığı yerlerde intra-artiküler basıncın artması sonucu kemik kistleri oluşur. Artan intra-artiküler basınç bu şekilde eklemi çevreleyen kemiğin iliğine iletilir. Basınç eşitlenene kadar kistler genişlemeye devam eder
Rejeneratif değişiklikler ortaya çıkarken kıkırdağın yıkım ürünlerinden oluşan debris, kemik hidroksiapatit kristalleri gibi materyallerle birlikte eklem aralığında depolanır. Parçalı sinovit alanları ve sinoviyal sıvı viskozitesinin artması ile kendini gösteren, patolojik ve klinik olarak enflamatuar bir yanıta neden olabilir. Bu enflamatuar yanıt daha fazla doku yıkımına neden olabilir, sonuçta eklemde effüzyon gelişerek intra-artiküler basıncın yükselmesine neden olur. Bunun sonucu olarak eklem kapsülünde gerginlik ve kalınlaşma ortaya çıkar.
Sinoviyal sıvının OA patofizyolojisinde henüz çok iyi tanımlanmamış olsa da rolü vardır. Sinoviyal sıvı basit bir sıvı ya da yağ değildir. Biyolojik bir rolü vardır ve bütün besin maddelerinin taşınması için ortam görevi görür, sinoviyal membranla birlikte hormonal ve mesajcı işlevleri olabilir. Majör bileşeni, polimerize glikozaminoglikan olan hiyaluronandır. Normal bir eklemde moleküler ağırlığı fazladır. Bu moleküller sinoviyal sıvıya şok abzorbe edici ve lubrikan olarak rol oynamasını sağlayan bazı biyolojik özelliklerini verirler
Osteoartritte Rol Oynayan Genetik Faktörler
Her ne kadar osteoartritin oluşumundaki çeşitli faktörler çok iyi tanımlansa da genetik faktörlerin bu hastalığın ortaya çıkmasında daha kuvvetli belirleyiciler oldukları bulunmuştur. OA’de rol oynayan genetik etkilere farklı kaynaklarda değinilmiş ve aile hikayesine dayanan epidemiyolojik çalışmalar, akraba ve ikiz çalışmaları, nadir genetik hastalıkların araştırılması esnasında farklı bulgular elde edilmiştir
Aile Çalışmaları
Etyolojisi tamamen değerlendirilebilen OA, ilk olarak Stecher tarafından parmaklarda Heberden nodları bulunan ailelerde çalışılmıştır. Kellgren tarafından İngiltere’de yapılan epidemiyolojik çalışmada ve Amerika’da yapılan bir diğer çalışmada, aile gruplarında el ve diz OA’i doğrulanmıştır. Düşük prevelansından dolayı kalça osteoartritini aile topluluklarında çalışmak çok zordur. Bu nedenle son zamanlarda toplumsal tabanlı çalışmalarda kalça osteoartritine ait veriler yoktur. Buna rağmen hastalığın prevelansını araştırmak için çeşitli çalışmalar kurulmuş, total eklem değişikliği gerçekleşmiş hasta bireyin kardeşinin kontrole göre 2-3 kat daha fazla OA’e yakalanma riski taşıdığı belirtilmiştir. Lanyon ve arkadaşları tarafından yapılan bir diğer çalışmada ise bu riskin 4.7 kat olduğu tespit edilmiştir
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (PCR/RFLP)
PCR/RFLP yöntemi ile mutasyonun araştırılacağı gen bölgesi, mutasyonu içine alacak şekilde çoğaltılır. Uzunluğunu bildiğimiz genomik DNA parçası, bakılacak mutasyona özgü olan restriksiyon endonukleaz enzimi yardımıyla kesilir. Kesilen genomik DNA, parçalarının büyüklüğüne göre agaroz ya da poliakrilamid jelde elektroforez işlemi ile yürütülür. Jel tercih edilen yönteme bağlı olarak, hazırlanmadan önce veya elektroforezden sonra etidyum bromür ile boyanıp ardından ultra viyole (UV) ışıkta görüntülenir. Kesim noktalarına göre
uzunlukları önceden bilinen parçalar değerlendirilerek mutasyonların varlığı ya da yokluğuna karar verilir.
Değerlendirme şu şekilde yapılır; hedef gen bölgesindeki nokta mutasyon, çoğaltılan DNA’da seçilen restriksiyon enziminin tanıma bölgesine özgülse mutasyonlu üründe kesim gerçekleşirken normal üründe kesim gerçekleşmez. Böylece kesilen ürünlere sahip bireyler mutasyonlu diğerleri normaldir. Tam tersine restriksiyon enziminin tanıma bölgesi mutasyona özgül değil de normal olan ürüne özgül ise kesim normallerde gerçekleşir, mutasyon olanlarda kesim gerçekleşmez. Değerlendirme, kesim olan ürünlere sahip bireyler normal, olmayanlar ise mutasyonludur şeklinde yapılır (25).
DNA Dizi Analizi
DNA dizi analizi DNA'nin nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir. Nükleotid dizilerinin
belirlenmesinde iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlar Maxam-Gilbert kimyasal degradasyon yöntemi ile Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemidir. Her iki yöntemin de dizi analizi yapılacak DNA'nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana aşaması bulunmaktadır.
a. Maxam-Gilbert Yöntemi: DNA parçası bir ucundan P32 ile işaretlenir. Bu işaretlenen DNA parçası dört örnek olarak bölünür. Her örneğe, DNA'daki bazlardan birisini tahrip edecek sekilde bir kimyasal madde eklenir. Daha sonra, piperidine kullanılarak, hasarlanmış nükleotidlerin bulunduğu yerlerden DNA yapısı fosfodiester bağlarından kırılır. Böylece P32 ile işaretlenmiş kısalı-uzunlu parçalar elde edilmiş olur. Daha sonra elektroforez ve otoradyografi ile sonuç alınır.
b. Sanger DNA dizi analiz yöntemi: En sık kullanılan Sanger'in yöntemi olup, asimetrik amplifikasyon ile elde edilmiş tek iplikçikli DNA; DNA Polimeraz enzimi ile ddNTP ve biri radyoaktif olarak işaretlenmiş dNTP kullanılır. Ortama radyoaktif P32, S35 veya P33 eklenir. İşaretleme primerlere yapılabileceği gibi, ortama eklenen dNTP'lerden birisinin radyoaktif olması yeterlidir. Burada en önemli nokta Dideoksinükleotidlerin (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) eklenmesidir. 2',3' Dideoksinukleosidtrifosfat’ ların (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP'lerden farklılığı deoksiribozun 3' noktasında hidroksil grubunun bulunmamasıdır. Büyüyen/sentezlenen DNA zincirine, DNA polimerazlar aracılığı ile bağlanabilirler. Bu bağlanma 5' trifosfat grupları aracılığı ile olur. Fakat, 3' hidroksil grubunun olmaması nedeniyle, ardından gelen dNTP'ler ile fosfodiester bağının oluşması engellenir. Doğal olarak DNA zincirinin daha fazla uzaması imkansız hale gelir. ddNTP ile klasik dört dNTP bir reaksiyon karışımının içine konduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarış olur, seyrek fakat spesifik sonlanmalar oluşur. Bu reaksiyon sonucunda, primer sonundan başlayıp; prematüre sonlanmaların olduğu bölgeler kadar uzunluktaki DNA parçaları ortaya çıkar. Dört farklı enzimatik reaksiyonda, dört farklı ddNTP kullanılarak (A,C,G,T için) birer reaksiyon elde edilir.
DNA dizi analizi süreci, tek iplikçikli DNA parçalarının hazırlanması; DNA dizi analizi tekniğinin uygulanması; DNA dizilerinin okunması-değerlendirilmesi ve ispatlayıcı tekrarlar biçimindedir. Eger dikkatli yapılırsa hata oranı %0.1'in altındadır. Bu hata oranına ulaşmak için; hedef DNA'nın her iki zincirine dizi analizi yapmak gereklidir
Mutasyon Tarama Yöntemleri
Kalıtsal hastalıkların prenatal ya da postnatal tanısı, veya populasyonda taşıyıcı taraması yapılarak hastalıkların önüne geçilmesi, aileye ve bireye verilen hem maddi, manevi hasarın önlenmesinde hem de topluluklar için gen frekanslarının belirlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Tanıyı kolaylaştırmak için bugüne kadar, pek çok mutasyon tarama yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemler, süre, pratik uygulanabilirlik, maliyet gibi özellikleri göz önünde tutularak kullanılır (19).
Küçük delesyonlar, insersiyonlar ve nokta mutasyonları için tek zincir konformasyon polimorfizm analizi (SSCP) (20), heterodubleks analizi (HA) (21), denatüre edici jel elektroforezi (DGGE) (22), restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP), allel spesifik amplifikasyon (ASA) (23) ve DNA dizi analizi gibi çeşitli mutasyon tarama teknikleri tanımlanmıştır. Mutasyon taraması için kullanılacak, metodun seçiminde gözönüne alınabilecek başlıca kriterler şunlardır; hangi tip biyolojik materyalin kullanılacağı, hangi tip nükleik asitin analiz edileceği, saptanacak mutasyonun daha önceden bilinip bilinmediği, saptanacak potansiyel mutasyonların ne kadar fazla olduğu, kullanılacak metodun ne kadar güvenilir olduğu ve ne ölçüde standardize edilebileceği, testin nasıl uygulanacağı, rutin tanı için uygun olup olmadığı, testin maliyeti ve kalite değerlendirmesi
Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi (SSCP)
Tek zincir konformasyon polimorfizmi (SSCP) analizi, bilinmeyen mutasyonların saptanması için kullanılan polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) bağlı bir mutasyon tarama yöntemidir. Bu yöntem nokta mutasyonlarının yanısıra küçük insersiyon ve delesyon mutasyonlarının saptanmasında tercih edilmektedir. Özellikle gen dizisi büyük olan proteinlerde dizi analizi yapılacak bölgeyi önceden saptamak amacı ile genin taranmasında en sık kullanılan yöntemlerden biridir ve DNA dizi analizine iyi bir alternatiftir. Mutasyon saptama oranı %80 ile %90 arasında değişmektedir. Bu analiz restriksiyon enzim analizini, blotting’i, problar ile hibridizasyonu gerektirmediğinden hızlı ve pratik bir yöntemdir.
Bu yöntemde PCR ürünleri denatüre edilir ve denatüre edici olmayan poliakrilamid jele uygulanır. Denatüre edilerek tek zincir haline getirilmiş DNA’ların zincir içi zayıf bağlarla kazandıkları yeni ikincil yapıları mutasyon sonucu değişebilir. Mutasyon sonucu oluşan bu ikincil yapıda oluşan konformasyon farkı o bölgenin elektroforezdeki hareketinde normal kontrol ile karşılaştırıldığında bir kaymaya, farklılığa neden olur. SSCP analizi genellikle tek iplikli DNA’daki konformasyon değişikliklerinden yararlanılarak mutasyonun varlığını tahmin etmekte kullanılmaktadır. Çift iplikli DNA’daki değişiklikleri göstermeyen bir yöntemdir.
Her SSCP analizi için optimal koşulların belirlenmesi gerekir. Analiz edilecek DNA parçasının büyüklüğü, jelin özellikleri (kullanılan poliakrilamid ile gliserol konsantrasyonu, denatüran ajan varlığı), elektroforez sırasında tercih edilen sıcaklık, elektroforez zamanı, PCR ürünlerinin denatürasyon yöntemi, mutasyonun tipi ve bulunduğu yer performansı etkiler.
SSCP analizinde en iyi sonuç, DNA 150-200 baz çifti uzunluğunda olduğu zaman elde edilir. Uzunluğu 150 baz çifti altında olan DNA fragmanlarında ikincil yapının oluşmasındaki güçlük nedeni ile SSCP analizinin duyarlılığı azalmaktadır. 200 baz çifti üzeri büyüklüğe sahip DNA’larda ise tek baz değişikliği ile daha az konformasyon değişikliği oluşacağı için bunun jelde görünmesi güçleşmekte ve büyük parçaların analizinde tespit edilen mutasyonların sayısı düşmektedir. Tek zincirli DNA’nın konformasyonu sıcaklığa hassastır. 17oC nin altı ve 23oC üzerindeki sıcaklıklar tek zincirli DNA’nın yarı stabil şekillerini bozabilmektedir. En iyi rezolüsyonu elde edebilmek için en çok tercih edilen oda sıcaklığıdır. Elektroforez sırasında jellerin ısıtılması önlenmelidir. 5V/cm voltajda 4W da ortalama 22oC de elektroforez yapıldığında jel fazla ısınmamakta ve jelin ısınma miktarı önemsiz olmaktadır. İçinden sıvı sirkülasyonu olan elektroforez sistemleri pahalı olmakla birlikte sıcaklığı standardize ettikleri için uygun sistemlerdir. İyi bir sonuç için yeterli hava konveksiyonu da gereklidir.
SSCP analizinde DNA parçalarını ayırmak için sıklıkla kullanılan matriks akrilamiddir.
Akrilamid/bisakrilamid oranı, toplam akrilamid ve gliserol yüzdesi, tampon içeriği jelin ayırma özelliğini belirler, en fazla tercih edileni, düşük çapraz bağlayıcı oranı ve %10 gliseroldür. Bazı SSCP’ler için yüksek yüzdeli jellerin kullanılması önerilmiştir. TEMED ve APS ile polimerize edilmiş, akrilamid benzeri hidrolink isimli jelin tek bir tipte gözenek büyüklüğüne sahip olduğu ve akrilamidden daha iyi rezolüsyon sağladığı belirtilmiştir. Yüksek rezolüsyon için ticari olarak bir çok özel jel matriksleri mevcuttur.
Şimdiye kadar rapor edilmiş jel uzunlukları 5-50 cm arasında değişmektedir. SSCP analizinde sonuçlar görsel değerlendirildiğinden iyi bir rezolüsyonun sağlanabilmesi için jelin boyutlarının uzun olması (yaklaşık 30x40 cm), elektroforez işlemlerinin düşük voltajda, uzun sürede yapılması ve ince bir jelin kullanılması gereklidir. Son yıllarda yapılan bir çok uygulamada standart sekans jelleri yerine mini jeller kullanılmıştır. Kısa jellerde keskin bant farklılıklarının gözlendiği bildirildiği halde %0,5 lik kayma farklılığının gözlenebilmesi için uzun elektroforezler tercih edilmelidir.
SSCP analizi için PCR ürünlerinin temiz ve spesifik olması gereklidir. Spesifik olmayan PCR ürünleri, kullanılmamış primerlerin varlığı, PCR siklus sayısının fazlalığı yanlış yorumlanabilecek bantlara neden olabilir. Genel olarak PCR ürünleri 96 oC de ısıtılarak denatüre edilir. Tek zincir haline gelmiş DNA lar hemen buz üzerine alınır ve hızla jele uygulanır. Örneğe güçlü denatüranların eklenmesi veya örneklerin 10-30 kat seyreltilmesi tek zincirlerin kendi kendine çift zincir oluşturmalarını en aza indirir. Denatüran olarak formamid, sodyum hidroksit, üre ve metil merkürik hidroksit kullanılabilir. Metil merkürik hidroksit toksiktir ama en etkili denatürandır. Özellikle ince jeller kullanıldığında denatüre edilmiş dilüe PCR ürünleri jele uygulandıkları noktada konsantre olurlar ve bir miktar renatürasyon gerçekleşir. Bu nedenle her zaman çift zincir DNA bantları tek zincir DNA bantlarından daha güçlü gözlenir.
daha iyi gözlenebilmesi için DNA'nın mümkün olduğunca sulandırılması gerekir. İnce jeller kullanıldığında tek zincir DNA'ların gözlenmesinde radyoaktif işaretleme, gümüş boyama ve etidyum bromide üstünlük sağlar.
Mutasyonun tipi ve bulunduğu yer SSCP analizinin duyarlılığını etkilemektedir. Mutasyon ikincil yapıya katılıyorsa SSCP analizinde mutasyon kolaylıkla saptanabilecektir. Eğer mutasyonun ikincil yapıyı oluşturmada rolü yoksa, mutasyon saptanmayabilir. Pürin içeriğinin daha fazla olduğu DNA tek zinciri jelde daha hızlı yürümekte ve daha belirgin değişiklikler göstermektedir. Guaninin Timine transversiyonu haricinde herhangi tip baz değişikliğinin sensitivite üzerine belirgin etkisi yoktur. Bir dizide heterozigot olarak bir değişim bulunuyorsa, bu dizinin SSCP analizi sonucunda dört farklı tek zincir DNA bandı oluşumu beklenir. Bunlar; normal allelin anlamlı ve anlamsız dizileri, ve mutant allelin anlamlı ve anlamsız dizileridir.SSCP analizi özel bir ekipmana ihtiyaç göstermeyen bir yöntem olduğu için basit ve hızlı bir tarama yöntemidir. SSCP analizinde mobilite farklılıkları görsel olarak değerlendirilir. Bu yüzden standardizasyonu kısıtlı ve otomasyona geçirilmesi de zordur. Optimal koşullar büyük oranda ampirik olarak tanımlanmıştır. Bir fragmanın farklı koşullarda analiz edilmesi mutasyonların tespit edilebilme olasılığını arttırır
