Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nedir

Mutasyon Analizlerinde Kullanılan Yöntemler

Hemofili B hastalığında, faktör IX geninde bulunan mutasyonlar üzerinde yapılan çalışmalar faktör IX gen ürününün yapısı ve fonksiyonu ile regülasyonu arasmdaki ilişkileri göstermesi bakımından önem arz etmektedir. Ayrıca bu mutasyonlann karakterizasyonu, doğru taşıyıcı tanısı yapılması ve prenatal tam testlerinin geliştirilmesi için doğrudan klinik uygulamaya sahiptir.

Tam amaçlı yapılan ilk moleküler çalışmalarda yüzlerce hemofili B ailesinde Restriksiyon fragment uzunluk polimorfizm [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)]'lerinin kullanılmasının gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu [Polymerase Chain Reaction (PCR)] ve PCR'ı temel alan teknolojilerin geliştirilmesinin ardından hastalığa sebep olan mutasyonlar belirlenmiştir. Bu sayede birçok laboratuarda hastalığın direkt tanısı olanaklı hale gelmiştir. Ancak pozisyonu bilinen mutasyonlarda yapılabilen direkt gen analiz yöntemleri, yüksek heterojenite gösteren faktör IX gibi gen yapılarında etkisiz kalmış ve gelişen moleküler tam teknolojileri ile mutasyon tarama analizleri (DGGE, SSCP gibi) yapılmıştır. Uygulama alam bulmasına rağmen, tam amaçlı mutasyon tarama çalışmalarının tümünün fazla zaman harcanmasının yamsıra yetersiz duyarlılığa sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca bu metodlar sonunda mutasyon tespiti için referans metod olarak kabul edilen DNA baz dizi analizini (sequencing) gerektirmektedir

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

DNA ve RNA analizi için kullanılan tüm teknikler değerlendirildiğinde, 1985'te Salki ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve kavramsal olarak basit bir prosedür olan polimeraz zincir reaksiyonu en fazla potansiyele sahip ve DNA analizlerinde yeni bir çağı başlatan tek yöntemdir. Polimeraz zincir rekasiyonunda birkaç saat içerisinde tek bir DNA ya da RNA molekülü birkaç milyon katına amplifiye edilebilmektedir. Bu yeteneği nedeniyle saç kökünden, ağız çalkantısındaki birkaç hücreden, kurumuş bir kan damlasından elde edilen tek bir hücreden izole edilen DNA materyalinden gerekli tüm analizlerin gerçekleştirilmesi mümkün olmaktadır.

Polimeraz zincir reaksiyonu incelenmek istenen DNA fragmentinin laboratuarda tüp içerisinde 5' ve 3' uçlarına özgü bu bölgelerdeki baz dizilerine komplementer bir çift primer kullanılarak, bu iki primer ile sınırlandırılan DNA parçasının enzimatik olarak bir milyon kez çoğaltılmasıdır. Bu yöntemin uygulamaya konması ile geniş kullanım alam bulmasındaki ana neden, tek bir hücreden izole edilen DNA'nın amplifikasyonu sonrası farklı analizlerde kullanılmasını olanaklı kılmasıdır. Polimeraz zincir reaksiyonunda DNA amplifikasyonu;

a. Denatürasyon (denaturation)

b. Bağlanma (annealing)

c. Uzama (extension) basamaklarından oluşan bir döngünün 25-30 kez tekrarlanması ile gerçekleşir.

Faktor 4 Geni ve Mutasyon Tipleri

Faktör 4 Geni Mutasyon Tipleri

Hemofili B hastalığının fenotipi faktör IX'un eksikliği veya disfonksiyonel olması sebebiyle meydana gelmektedir. Bu olay faktör IX'un pıhtılaşma mekanizmasındaki etkileşimlerini geciktirir veya önler.

Hemofili B hastalığı, faktör IX genindeki mutasyonlar sebebiyle meydana gelmekte olup, hastalığın şiddeti gendeki mutasyonun lokalizasyonu ve yapısıyla yakından ilgilidir. Hemofili B hastahğı'nın moleküler temeli heterojenite göstermektedir. Faktör IX geninin, 1985 yılında dizilenmesinin ardından, 1713 hemofili B hastasında mutasyonlar bildirilmiş ve 652 moleküler olay tanımlanmıştır. Faktör IX proteininin komplex bir süreçten geçmesi ve multipl fonksiyonel alanlara sahip olması, hemofili B hastalığında gözlenen moleküler defektlerin heterojenitesini açıklamaktadır. 1990 yılında bir veri tabam oluşturulup, dünyadaki bir çok hemofili merkezinden toplanmış hemofili B olgu serilerinin analizi ile, günümüze kadar bir çok mutasyon bildirilmiştir. İnternette oluşturulan hemofili B veri tabanında (http://www.umds.ac.uk/molgen) 1713 hemofili B hastasının fenotipine ait ayrıntılar ve ilgili mutasyonlar sıralanmıştır.

Hemofili B hastalığına neden olan moleküler defektlerin 1/3'ü de novo mutasyonlardır. Büyük delesyonlar, mikro delesyonlar, insersiyonlar, missens ve nonsens nokta mutasyonlannın hepsi tanımlanmıştır. Hastalığın % 85'ine neden olan mutasyonlar tek baz değişimlerinden kaynaklanırken, büyük ve kompleks gen yeniden düzenlenmeleri nadirdir.

Faktör IX genindeki büyük delesyonlar antijen-negatif hemofili B'ye neden olur Bu delesyonlar faktör IX mutasyonlannın % 6'sını oluşturmakla birlikte içlerinden bazıları ardışık pürin - pirimidin segmentlerinin büyük hair-loop yapısı oluşturmasından kaynaklanır. Büyük delesyonlar komplet ve parsiyel gen delesyonlanm içermektedir. Ancak günümüze kadar hiçbir komşu gen sendromu tanımlanmamıştır

Faktor IX Geninin Yapisi

Faktör IX Geninin Yapısı

Faktör IX, K vitaminine bağımlı bir plazma proteini olup kan koagülasyonun orta aşamalarında işlev görür. Bu faktör, bir serin proteazm zimojeni olarak kanda dolaşan tek zincirli bir glikoproteindir

56.000 molekül ağırlığında olan bu plazma proteini kanın pıhtılaşmasına orta düzeyde katkı sağlar (16). Faktör IX, Ca²⁺'un varlığında faktör XIa tarafından serin proteaza yani faktör IXa'ya aktiflenmektedir. Bu da sonra 2-zincirli serin proteaz yani faktör Xa'yı üretmek için faktör X'daki Arg-Il'e bağını parçalar. Faktör Xa, intrinsik ve ekstrİnsik yolların aynı noktaya yaklaştıkları ve kan koagülasyonun ortak sonlanma yoluna yöneldikleri konumda bulunur.

Faktör IX, 12 6-karboksiglutamik asit rezidüsü ile proteinin amino terminal bölgesinde yer alan (3- hidroksiaspartik asidin bir rezidüsünü içerir.

İnsan koagülasyon faktörlerinden birisi olan faktör IX'u kodlayan gen, sığır faktör IX amino asit sekansı kullamlarak ilk kez 1982 yılında klonlanmıştır. 1984 yılında ise X kromozomonun uzun kolunun distal bölümüne lokalize edilmiştir. Genin komple dizilemesi 1985 yılında tanımlanmıştır.

Faktör IX geni, 34 kb uzunlukta olup 8 ekzon ve 7 intron içeren bir gendir. Bu gen X kromozomonun uzun kolunda Xq27.1 bandında yer almaktadır. Bütün genin uzunluğu 34 kb olmakla birlikte mRNA'nm uzunluğu sadece 1.4 kb'dır. İntronlar genin yaklaşık % 95'ini oluşturur.

Ekzon uzunlukları 25 bp ile 1935 bp arasında değişmektedir. Promoter bölgesi çok iyi bilinmemekle birlikte, transkripsiyon faktörlerinden karaciğer nükleer faktör 1(NF1-L) ve CCAAT/enhancer-bağlanma proteinleri(C/EBP)'nin sırasıyla 99 dan - 76 ve +1 den +18'e kadar olan nükleotidlere bağlandıkları bilinmektedir.

Faktör IX geninde bulunan 8 ekzon, faktör IX'un 6 majör alanım kodlamaktadır. Ekzon 1, sinyal peptidini kodlar. Ekzon 2, faktör DC'un Gla alanını ve propeptidi kodlar. Ekzon 3, Gla proteinlerinin heterodimerizasyonunu kolaylaştıran kısa bir hidrofobik alam kodlar (35). Ekzon 4 ve 5 tarafından iki epidermal büyüme faktörü (EGF)'ne benzer alan kodlanır. Bunlardan ilki tip (B), Ca²⁺ bağlanma alanına yüksek afiniteye sahip olup p - hidroksilasyon yoluyla post-translasyonel olarak modifiye olan Asp 64'ü içerir. 35 residü peptid içeren ekzon 6, aktif peptidi ve onu kuşatan dizinleri kodlar.

Bu alandaki amino asitlerin % 23'ü jeneriktir, % 37'si ise faktör IX özelliğindedir. Bu sayılar aktif peptidin K vitaminine bağlı serin proteazlar ve 8 memeli türünün faktör IX genleri arasında en az korunan alan olduğunu göstermektedir. Ekzon 7 ve 8, katalitik alam birlikte kodlar. Burada katalitik alam beş ekzonun kodladığı protrombinin tersine iki ekzon kullanılmaktadır. Bu zıtlık, faktör IX geninin, protrombinin bir prekürsöründen atasal olarak türediğini düşündürmektedir. Bu katalitik alan % 69 jenerik olup, % 34 faktör IX'a spesifik amino asit rezidülerini içerir. Katalitik alanın amino asit rezidüleri Ca²⁺, fosfolipid ve faktör Villa varlığında faktör X'un aktivasyonu için gereklidir