Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH)
Moleküler biyoloji hastalıkların genetik etiyolojisinin anlaşılmasına yardımcı birçok yeni tekniklerin gelişimine yol açmıştır. Bunlardan biri olan FISH sitogenetik ve gen haritalaması çalışmalarında yaygın deneysel tekniklerden biri haline gelmiştir. Bu yöntem genellikle moleküler sitogenetik olarak adlandırılmaktadır
DNA molekülü gelişen teknolojiyle beraber incelenmesi en kolay moleküllerden biri haline gelmiştir. Belirli bir DNA parçası sınırsız şekilde çoğaltılabilmekte, nükleotid dizileri çok kısa sürede saptanabilmekte, aynı tekniklerdeki varyasyonlar ile izole bir gen değiştirilebilmekte ve tekrar kültürdeki hücrelere verilmektedir. Tüm bu gelişmeler rekombinant DNA teknolojisi adı altında toplanan ve 1970’li yıllardan itibaren takip edilmesi güç bir hız ile geliştirilen teknikler sayesinde olmuştur. Bu ilerlemelere ortam hazırlayan üç temel gelişme vardır:
1. DNA’nın spesifik bölgelerden restriksiyon enzimleri ile kesilmesi,
2. Saflaştırılmış DNA fragmentindeki tüm nukleusların sekanslanması,
3. Nükleik asitlerin kendilerine komplementer olan diğer bir nükleik asit fragmenti ile karşılıklı gelebileceği ilkesi ile DNA-DNA, DNA-RNA yada RNA-RNA fragmentleri arasında hibridizasyonun yapılmasıdır
Floresanlanmış nükleotid analoglarının direkt ve indirekt ISH (In Situ Hibridizasyon ) yöntemlerinde kullanılmaya başlamasıyla (1991) bir alt dal oluşmuştur ki bu da FISH’dir. FISH ile komplementer DNA fragmentleriyle spesifik nükleik asit sekansları hibridize edilmekte, böylece kromozom kopya sayıları ve genlerin lokalizasyonları belirlenebilmektedir. Karyotip analizleri veya konvansiyonel metafaz sitogenetiğiyle karşılaştırıldığında, FISH büyük avantajlar sağlamaktadır. Kromozomların interfazda da bir alan oluşturdukları ve spesifik problarla bu alanların yapı ve kısmen miktarı konusunda bilgi alınabileceği görülmüş ve böylece ISH ile ‘’interfaz sitogenetiği’’ analizi adı verilen alt bir dal doğmuştur. İnterfaz nukleusunda kromatin metafaz kromozomlarından daha az kondensedir ve böylece high rezolusyon FISH için doğal hedef olmuştur. Metafaz kromozomlarında rezolüsyon >1 Mb yüksek rezolüsyonla uzatılmış kromozomlarda rezolüsyon >200 kb iken, interfaz nukleusunda bu değer 1 kb’dır
FISH doku kültürüne ihtiyaç duyulmadan solid tümörlere hatta formolde fikse edilmiş, parafin bloklu dokulara dahi uygulanabilmektedir. Anöploidilerin değerlendirilmesinde FISH Flow Cytometry’den daha hassastır. Artık DNA anöploidisi ve prognoz arasınaki ilişkinin tayininde FISH uygulanmaktadır.
FISH tekniğinin tanı ve araştırma amaçlı kullanım alanlarını şöyle sıralayabiliriz:
A) Tanısal amaçlı kullanılan FISH
1. Klinik sitogenetik
a. Prenatal tanı
b. İnterfaz sitogenetiği
c. Mikrodelesyon sendromlarının tanısı
d. Kanser sitogenetiği
2. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısı
3. Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin değerlendirilmesi
B) Araştırma amaçlı FISH
1. Gen haritalaması
2. Tümör biyolojisi
3. Mikrobiyoloji/viroloji
4. Gen ekspresyon analizi
5. Somatik hücre hibrit analizleri
6. Mayoz/mitoz analizleri
7. Hücre tanımlaması
Tüm ISH yöntemlerinde temel prensip aynıdır. Prob olarak kullanılan DNA molekülü işaretlenir, yani eksojen olarak reaksiyona sokulan işaretli nükleotid, prob DNA’sındaki uygun nükleotid ile yer değiştirir. Prob işaretlendikten sonra lam/lamel üzerine fikse edilen metafaz ve/veya interfazdaki proteinler uzaklaştırılır, çift sarmal halde bulunan gerek prob gerekse hedef DNA’lar denatürasyon ile tek zincir haline getirilir. Önceden işaretlenmiş prob ile spesifik eşleşmenin olacağı uygun koşullarda genomik DNA hibridize edilir.
