Hibridizasyon Nedir

Hibridizasyon Nedir

‘Hibridizasyon’un kelime anlamı, ‘birbirini tamamlayan moleküllerin birleşmesi’dir. Birbirlerini tamamlayan nükleik asitler DNA ya da RNA olabilir. Moleküller arasındaki bağlanma esas olarak hidrojen bağıyla sağlanır. Bu bağlar adenin ile timin arasında iki, guanin ile sitozin arasında üç hidrojen bağı şeklinde oluşur. Hibridizasyon, moleküler biyolojide, özgün nükleik asit dizilerini tanımlamak için kullanılan güçlü bir yöntemdir. İki tamamlayıcı nükleik asit dizisinin (iplikçiğin), uygun ortamda çiftli DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA yapılar oluşturması olarak tanımlanabilir. Tek zincirli nükleik asitlerin çift zincirli yapılar yapmaya eğilimi, bu yöntemin temelini oluşturmaktadır.
Bu yöntemin ilk aşaması, DNA’nın çift heliks yapısının ısı ve/veya yüksek pH(>13) ile karşılaştığında bozulması ve tekli diziler halini almasıdır ki “denatürasyon” olarak adlandırılır . Ancak tekli diziler uygun tamamlayıcı dizilerle tekrar ikili yapılar halini alırlar (Hybridizasyon-DNA renaturation, reassociate, reanneal). Tekli dizilerden en az birine, işaretleyici bir molekül (radyoizotop, floresein vb) bağlandığı takdirde, özgün ikili yapılar laboratuvarda çeşitli yöntemlerle saptanabilmekte ve böylelikle hibridizasyon ya da bağlanmanın gerçekleştiği anlaşılabilmektedir. Burada tamamlayıcı sekansları bulmak için kullanılan işaretli dizilere ‘prob’ adı verilir. Probun özgün olduğu nükleik asit dizisi ise hedef (target) olarak adlandırılır. İşaret, floresan boya maddesi olabileceği gibi, IM ile görülebilecek nonfloresan bir boya maddesi de olabilir. İşaretleyicinin tipine göre hibridizasyon işleminin adı değişecektir. Hibridizasyon işlemimizin adı; probumuzda işaret olarak floresan boya maddesi mevcut ise FISH, IM ile görülebilecek nonfloresan bir boya maddesi mevcut ise CISH olacaktır.

Formalin Nedir ve Ne Ise Yarar

Formalin Nedir ve Organizmaya Etkileri ve Ne İşe Yarar

Patoloji laboratuvarlarımızın çoğunda, uygun havalandırma sistemi ve işlemi biten dokuların depolanacağı çalışma ortamından ayrı odalar mevcut değildir. Çalışanlar, dokuların içerisinde saklandığı mevcut formalinin buharlaşmasına bağlı belli seviyede formaldehite sürekli olarak maruz kalmaktadır. Ayrıca makroskopik inceleme, paraformaldehitten solüsyon hazırlama, formalin hazırlanması, örneklerin formaline transferi, kullanılmış formalinin atık bidonlarına aktarımı gibi durumlarda, kısa süreli ancak daha yüksek seviyeli formaldehit maruziyeti söz konusudur.

Formalin buharının havadaki konsantrasyonu ppm (part per million) ile ifade edilmektedir. 1 ppm, 1m3 havadaki 1.248 mg formalin buharına eşittir (6, 7). Hissedilebilir formaldehit düzeyi 0.1-0.5 ppm (parts per million, yaklaşık 0.12-0.6 mg/m3) iken, 0.5-1.0 ppm (0.6-1.2 mg/m3) formaldehit göz irritasyonuna, 1.0 ppm’nin üzerinde formaldehit ise burun ve boğaz irritasyonuna neden olmaktadır.

OSHA (The Occupational Safety and Health Administration) tarafından belirlenmiş ve kabul edilen formalin buharı güvenlik düzeyleri TWA*: 1 ppm, STEL*: 2 ppm, TLV*: 0.50-0.75 ppm’dir. Patoloji laboratuvarlarındaki formaldehit maruziyetinin yüksek olduğu ve 0.5 mg/m3 limitini sıklıkla aştığı bildirilmektedir. IARC kaynaklarında patologlarda STEL düzeyleri 3 ppm ve üzerinde ölçülmüştür (6, 8). Ayrıca formalin IARC Grup 1 kategorisinde yer alan bir karsinojendir.
Carnoy fiksatifi: Glasiyel asetik asit, absolü etanol ve kloroformdan meydana gelen bir karışım fiksatiftir. Her türlü dokunun tespitinde kullanılabilir. Hızlı penetrasyon gösterir ve bu nedenle bazı laboratuvarların acil işlem gerektiren biyopsileri için yeğlenmektedir. Glikojen ve plazma hücreleri için iyi bir fiksatiftir. Ayrıca, nükleik asitlerin incelenmesini gerektiren durumlarda da önerilmektedir. Büzülme ve sertleşmeyi önlemek için dört saatten fazla tespit yapılmamalıdır. Kloroform tehlike yaratabilir. Ayrıca kollajen iyi korunmaz ve asit fast basiller boyanmaz. Eritrositler lizise uğrar.
Bouin solüsyonu: Pikrik asit, formaldehit ve asetik asitten meydana gelen bir karışım fiksatiftir. Özellikle küçük biyopsiler için yeğlenir. Klasik olarak testis biyopsilerinin tespitinde önerilmektedir. Eritrositler lizise uğrar ve demir ile küçük kalsiyum depolanmaları çözünürler. Pikrik asit DNA degradasyonuna yol açabildiğinden, dokuların intakt DNA gerektiren çalışmalarda kullanılmasıyla çelişir.
Hollande solüsyonu: Pikrik asit, formalin, asetik asit, bakır asetattan meydana gelen bir karışım fiksatiftir. Bouin solüsyonunun modifikasyonudur. Özellikle lenfoid sistem ve gastrointestinal traktüse ait olanlar olmak üzere, küçük biyopsilerin tespitinde kullanılır. Bouin’e benzer dezavantajları vardır.

Fiksatif Nedir, Günümüzde Kullanılan Fiksatifler ve Özellikleri

Evrensel Fiksatif: Formalin
Uzunca bir süredir dünya genelinde, patoloji laboratuvarlarında standart fiksatif olarak kullanılagelmiş bu kıymetli solüsyonun patolojideki yerini anlayabilmek için, dokudaki etkisini ve bu etkiyi nasıl gerçekleştirdiğini bilmek önemlidir. Dolayısıyla öncelikle, doku formalin ile karşılaştığında kimyasal ve moleküler düzeyde nelerin olup bittiğine göz atmak gerekir.
Formalin, formaldehitin sudaki %40’lık çözeltisidir. Patoloji laboratuvarlarında, standart fiksatif olarak, 1 hacim formalinin (formalinin, formaldehitin %40’lık çözeltisi olduğunu tekrarlamak istiyorum!) 9 hacim su ile karıştırılmasıyla elde edilen “%10’luk formalin” kullanılmaktadır. Dolayısıyla %10’luk formalin, formaldehitin sudaki %4’lük çözeltisidir (40/100x10/100=4/100).
Aldehitler olarak bilinen organik molekül sınıfının en basit üyesi olan formaldehit (CH2O), solüsyon içerisinde polimerize olma eğilimindedir. Yani, monomerik subünitler (CH2O) bir araya gelerek, molekül ağırlığı daha yüksek agregatlar oluştururlar. %10’luk formalin içerisinde ise, formaldehit genellikle monomerik formda bulunur. Ancak fiksasyon ile polimerizasyon belirginleşmeye başlar ve polimerizasyon ile de molekül ağırlığı artan formaldehit moleküllerinin penetrasyon hızı yavaşlar (moleküler ağırlık ve penetrasyon hızı genellikle ters orantılıdır). Bu nedenle de, üreticiler, polimerizasyonun önüne geçmeye yardımcı olması amacıyla, formalin solüsyonuna metanol eklerler. Metanol her ne kadar bir alkol olsa da (bir aldehit değil) görece formaldehite yakındır. İki molekül arasındaki tek fark şudur: metanolde C ve O atomları tek bağ ile bağlı iken (C-OH); aldehitte C ve O atomları çift bağ ile bağlıdır (H-C=O). Bu da ayrıca metanolün vücuda neden toksik olduğunu gösterir. Sindirilmiş ya da absorbe edilmiş metanol, vücutta formaldehite ve formaldehitin oksidasyon ürünü olan formik asite oksidize edilir (oksidasyon zinciri metanol-formaldehit-formik asit şeklinde gider).
Formaldehit, non-koagülan bir fiksatiftir. Dokuya kimyasal olarak bağlanırken, kendinden sonra gelen belirtecin penetrasyonunu engelleyecek jel-benzeri bir matriks oluşumuna neden olmaz. Formaldehitin başlıca bağlandığı doku kısımları, aminoasitlerde (aa) bulunan reaktif hidrojen atomlarıdır. Bütün aa’ler, molekülün bir ucunda bir amino grubu (-NH2) ve diğer uçta ise bir karboksil grubu (-CO2H) içerir. Böylelikle bir protein oluşturmak üzere biraraya gelip bağlandıklarında, proteinin bir ucu bir amino grubu (N-terminali), diğer ucu ise bir karboksil grubu (C-terminali) olacaktır. Formaldehit molekülü çoğunlukla, proteinlerin N-terminali ile etkileşir ve protein molekülleri arasında metilen köprüleri (H-C-H) oluşturur. N-terminali ile olan bu reaksiyonun, formalin solüsyonlarının pH’sına ve aa’lerin biyokimyasal özelliklerine bağlı olduğu düşünülmektedir. Formaldehit ayrıca aa sisteini içindeki sülfidril gruplarına da bağlanarak, proteinleri daha ileri stabilize eden çapraz bağlar oluşturur. Bu köprüler ve çapraz bağlar, dokuyu stabilize edip korumakla birlikte, çeşitli İHK prosedürlerinde epitop açığa çıkarma (retrieval) basamağına ihtiyaç duyuran oluşumlardır.
Formalin fiksatif olarak kullanılırken, solüsyonun pH’ı dikkat edilmesi gereken özelliklerdendir. Yukarıda da belirtildiği gibi, formalin solüsyonu olağan pH aralığında iken, formaldehit molekülleri normal olarak proteinlerin N-terminal ucu ile bağlanacaktır. Bu pH, genelde nötrale yakındır. Bir formaldehit solüsyonunun pH’ı çok asidik olduğunda, bu solüsyona maruz kalan kanlı dokularda, asidik ortamın hemoglobin üzerinde yaptığı etki sonucu, koyu kahverengi/siyah renkli, insolubl, yapay bir pigment oluşur. Bu pigment hematin (asit hematin, formalin pigmenti, formene) olarak isimlendirilir. Bu nedenlerle, formalin solüsyonlarının pH’ı genelde 6’nın üzerinde tutulur.
Formalin, atmosferik oksijene maruz kaldığında formik aside oksidize olmaya meyilli olduğundan, solüsyonların çoğu hematin pigment oluşumunu inhibe etmek için tamponlanır. Yaygın olarak kullanılan tampon fosfattır (5). Etkili bir tamponlayıcı olmakla birlikte, fosfatı formalin içinde kullanırken, fosfat çökeltisi oluşumunu önlemek amacı ile, dehidrasyon işlemi maksimum %70 konsantrasyonda başlanmalıdır. Bu çökeltiler, dokuda yapay kalıntılara neden olabilir ve daha fazlası, alkol tüpünde blokaja neden olabilir. Bu oluşumu önlemek için, ilk alkolü %70 ya da daha düşük tutmaya ek olarak, fosfat dışında bir başka tampon ile tamponlanmış formalin solüsyonu da kullanılabilir. Bu fiksatifler fosfat-tamponlularla aynı sonuçları verir ve fosfat çökelti oluşumu problemi de olmaz.

Fiksasyon Nedir

Fiksasyon Nedir 

Fiksasyon, klasik doku takip işleminin ilk aşamasıdır. Dokunun canlı organizmadaki durumuna en yakın şekilde sabitlenip (protoplazmadaki protein, lipid, karbonhidrat ve diğer maddeleri koagüle veya presipite ederek), dış etkenlere dirençli hale getirilmesidir.

Fiksasyon işleminde başlıca hedefler şunlardır 

1.   Hücresel enzimlerin neden olacağı otolizi önlemek,

2.  İnfeksiyöz ajanları inaktive etmek/öldürmek ve bakteriyel hasarı önlemek,

3.   Dokuyu şekil ve hacim açısından sabitleştirmek,

4.   Dokunun canlıdaki yapısına olabildiğince benzer şekilde korunmasını sağlamak,

5.   Dokuyu daha sonra uygulanacak takip işlemlerine dayanıklı hale getirmek,

6.   Dokuyu daha sonra uygulanacak boyama ve inceleme yöntemlerine elverişli hale getirmek. 

Tespit için kullanılan ajanlar fiksatif olarak adlandılır. Maalesef yukarıda sıralanan fiksasyon hedeflerinin tümünü karşılayan tek bir fiksatif mevcut değildir. Günümüze kadar, her biri bir ya da birkaç açıdan diğerinden üstün, farklı yapıda çeşitli fiksatifler üretilmiştir. Bu fiksatifler aşağıdaki gibi sınıflandırılmaktadır: 

1.   Aldehitler (formaldehit, gluteraldehit, glyoxal, acrolein),

2.   Oksitleyiciler (osmium tetroksid, potasyum permanganat, potasyum dikromat),
3.   Protein denatürasyonu yapanlar veya koagülanlar (etil alkol, metil alkol, asetik asit),
4.   Çapraz bağ yapan diğer ajanlar (carbodiiminler),
5.   Fiziksel ajanlar (ısı, mikrodalga),
6.   Diğerleri (civa klorür, pikrik asit, boya maddeleri).
Uzunca bir süredir, patoloji labortuvarlarının genelinde yaygın şekilde kullanılan fiksatif, aldehit grubu fiksatiflerden olan formalindir. Patolojide kullanılan diğer fiksatifler arasında Carnoy gibi alkol bazlı fiksatifler yanısıra, formaldehit içeren Bouin ve B5 gibi fiksatifler bulunmaktadır.