Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (PCR/RFLP)

PCR/RFLP yöntemi ile mutasyonun araştırılacağı gen bölgesi, mutasyonu içine alacak şekilde çoğaltılır. Uzunluğunu bildiğimiz genomik DNA parçası, bakılacak mutasyona özgü olan restriksiyon endonukleaz enzimi yardımıyla kesilir. Kesilen genomik DNA, parçalarının büyüklüğüne göre agaroz ya da poliakrilamid jelde elektroforez işlemi ile yürütülür. Jel tercih edilen yönteme bağlı olarak, hazırlanmadan önce veya elektroforezden sonra etidyum bromür ile boyanıp ardından ultra viyole (UV) ışıkta görüntülenir. Kesim noktalarına göre

uzunlukları önceden bilinen parçalar değerlendirilerek mutasyonların varlığı ya da yokluğuna karar verilir.
Değerlendirme şu şekilde yapılır; hedef gen bölgesindeki nokta mutasyon, çoğaltılan DNA’da seçilen restriksiyon enziminin tanıma bölgesine özgülse mutasyonlu üründe kesim gerçekleşirken normal üründe kesim gerçekleşmez. Böylece kesilen ürünlere sahip bireyler mutasyonlu diğerleri normaldir. Tam tersine restriksiyon enziminin tanıma bölgesi mutasyona özgül değil de normal olan ürüne özgül ise kesim normallerde gerçekleşir, mutasyon olanlarda kesim gerçekleşmez. Değerlendirme, kesim olan ürünlere sahip bireyler normal, olmayanlar ise mutasyonludur şeklinde yapılır (25).

DNA Dizi Analizi

DNA dizi analizi DNA'nin nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir. Nükleotid dizilerinin
belirlenmesinde iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlar Maxam-Gilbert kimyasal degradasyon yöntemi ile Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemidir. Her iki yöntemin de dizi analizi yapılacak DNA'nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana aşaması bulunmaktadır.

a. Maxam-Gilbert Yöntemi: DNA parçası bir ucundan P32 ile işaretlenir. Bu işaretlenen DNA parçası dört örnek olarak bölünür. Her örneğe, DNA'daki bazlardan birisini tahrip edecek sekilde bir kimyasal madde eklenir. Daha sonra, piperidine kullanılarak, hasarlanmış nükleotidlerin bulunduğu yerlerden DNA yapısı fosfodiester bağlarından kırılır. Böylece P32 ile işaretlenmiş kısalı-uzunlu parçalar elde edilmiş olur. Daha sonra elektroforez ve otoradyografi ile sonuç alınır.
b. Sanger DNA dizi analiz yöntemi: En sık kullanılan Sanger'in yöntemi olup, asimetrik amplifikasyon ile elde edilmiş tek iplikçikli DNA; DNA Polimeraz enzimi ile ddNTP ve biri radyoaktif olarak işaretlenmiş dNTP kullanılır. Ortama radyoaktif P32, S35 veya P33 eklenir. İşaretleme primerlere yapılabileceği gibi, ortama eklenen dNTP'lerden birisinin radyoaktif olması yeterlidir. Burada en önemli nokta Dideoksinükleotidlerin (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) eklenmesidir. 2',3' Dideoksinukleosidtrifosfat’ ların (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP'lerden farklılığı deoksiribozun 3' noktasında hidroksil grubunun bulunmamasıdır. Büyüyen/sentezlenen DNA zincirine, DNA polimerazlar aracılığı ile bağlanabilirler. Bu bağlanma 5' trifosfat grupları aracılığı ile olur. Fakat, 3' hidroksil grubunun olmaması nedeniyle, ardından gelen dNTP'ler ile fosfodiester bağının oluşması engellenir. Doğal olarak DNA zincirinin daha fazla uzaması imkansız hale gelir. ddNTP ile klasik dört dNTP bir reaksiyon karışımının içine konduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarış olur, seyrek fakat spesifik sonlanmalar oluşur. Bu reaksiyon sonucunda, primer sonundan başlayıp; prematüre sonlanmaların olduğu bölgeler kadar uzunluktaki DNA parçaları ortaya çıkar. Dört farklı enzimatik reaksiyonda, dört farklı ddNTP kullanılarak (A,C,G,T için) birer reaksiyon elde edilir.
DNA dizi analizi süreci, tek iplikçikli DNA parçalarının hazırlanması; DNA dizi analizi tekniğinin uygulanması; DNA dizilerinin okunması-değerlendirilmesi ve ispatlayıcı tekrarlar biçimindedir. Eger dikkatli yapılırsa hata oranı %0.1'in altındadır. Bu hata oranına ulaşmak için; hedef DNA'nın her iki zincirine dizi analizi yapmak gereklidir

Mutasyon Tarama Yontemleri

Mutasyon Tarama Yöntemleri

Kalıtsal hastalıkların prenatal ya da postnatal tanısı, veya populasyonda taşıyıcı taraması yapılarak hastalıkların önüne geçilmesi, aileye ve bireye verilen hem maddi, manevi hasarın önlenmesinde hem de topluluklar için gen frekanslarının belirlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Tanıyı kolaylaştırmak için bugüne kadar, pek çok mutasyon tarama yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemler, süre, pratik uygulanabilirlik, maliyet gibi özellikleri göz önünde tutularak kullanılır (19).

Küçük delesyonlar, insersiyonlar ve nokta mutasyonları için tek zincir konformasyon polimorfizm analizi (SSCP) (20), heterodubleks analizi (HA) (21), denatüre edici jel elektroforezi (DGGE) (22), restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP), allel spesifik amplifikasyon (ASA) (23) ve DNA dizi analizi gibi çeşitli mutasyon tarama teknikleri tanımlanmıştır. Mutasyon taraması için kullanılacak, metodun seçiminde gözönüne alınabilecek başlıca kriterler şunlardır; hangi tip biyolojik materyalin kullanılacağı, hangi tip nükleik asitin analiz edileceği, saptanacak mutasyonun daha önceden bilinip bilinmediği, saptanacak potansiyel mutasyonların ne kadar fazla olduğu, kullanılacak metodun ne kadar güvenilir olduğu ve ne ölçüde standardize edilebileceği, testin nasıl uygulanacağı, rutin tanı için uygun olup olmadığı, testin maliyeti ve kalite değerlendirmesi

Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi (SSCP)

Tek zincir konformasyon polimorfizmi (SSCP) analizi, bilinmeyen mutasyonların saptanması için kullanılan polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) bağlı bir mutasyon tarama yöntemidir. Bu yöntem nokta mutasyonlarının yanısıra küçük insersiyon ve delesyon mutasyonlarının saptanmasında tercih edilmektedir. Özellikle gen dizisi büyük olan proteinlerde dizi analizi yapılacak bölgeyi önceden saptamak amacı ile genin taranmasında en sık kullanılan yöntemlerden biridir ve DNA dizi analizine iyi bir alternatiftir. Mutasyon saptama oranı %80 ile %90 arasında değişmektedir. Bu analiz restriksiyon enzim analizini, blotting’i, problar ile hibridizasyonu gerektirmediğinden hızlı ve pratik bir yöntemdir.
Bu yöntemde PCR ürünleri denatüre edilir ve denatüre edici olmayan poliakrilamid jele uygulanır. Denatüre edilerek tek zincir haline getirilmiş DNA’ların zincir içi zayıf bağlarla kazandıkları yeni ikincil yapıları mutasyon sonucu değişebilir. Mutasyon sonucu oluşan bu ikincil yapıda oluşan konformasyon farkı o bölgenin elektroforezdeki hareketinde normal kontrol ile karşılaştırıldığında bir kaymaya, farklılığa neden olur. SSCP analizi genellikle tek iplikli DNA’daki konformasyon değişikliklerinden yararlanılarak mutasyonun varlığını tahmin etmekte kullanılmaktadır. Çift iplikli DNA’daki değişiklikleri göstermeyen bir yöntemdir.
Her SSCP analizi için optimal koşulların belirlenmesi gerekir. Analiz edilecek DNA parçasının büyüklüğü, jelin özellikleri (kullanılan poliakrilamid ile gliserol konsantrasyonu, denatüran ajan varlığı), elektroforez sırasında tercih edilen sıcaklık, elektroforez zamanı, PCR ürünlerinin denatürasyon yöntemi, mutasyonun tipi ve bulunduğu yer performansı etkiler.
SSCP analizinde en iyi sonuç, DNA 150-200 baz çifti uzunluğunda olduğu zaman elde edilir. Uzunluğu 150 baz çifti altında olan DNA fragmanlarında ikincil yapının oluşmasındaki güçlük nedeni ile SSCP analizinin duyarlılığı azalmaktadır. 200 baz çifti üzeri büyüklüğe sahip DNA’larda ise tek baz değişikliği ile daha az konformasyon değişikliği oluşacağı için bunun jelde görünmesi güçleşmekte ve büyük parçaların analizinde tespit edilen mutasyonların sayısı düşmektedir. Tek zincirli DNA’nın konformasyonu sıcaklığa hassastır. 17oC nin altı ve 23oC üzerindeki sıcaklıklar tek zincirli DNA’nın yarı stabil şekillerini bozabilmektedir. En iyi rezolüsyonu elde edebilmek için en çok tercih edilen oda sıcaklığıdır. Elektroforez sırasında jellerin ısıtılması önlenmelidir. 5V/cm voltajda 4W da ortalama 22oC de elektroforez yapıldığında jel fazla ısınmamakta ve jelin ısınma miktarı önemsiz olmaktadır. İçinden sıvı sirkülasyonu olan elektroforez sistemleri pahalı olmakla birlikte sıcaklığı standardize ettikleri için uygun sistemlerdir. İyi bir sonuç için yeterli hava konveksiyonu da gereklidir.
SSCP analizinde DNA parçalarını ayırmak için sıklıkla kullanılan matriks akrilamiddir.

Akrilamid/bisakrilamid oranı, toplam akrilamid ve gliserol yüzdesi, tampon içeriği jelin ayırma özelliğini belirler, en fazla tercih edileni, düşük çapraz bağlayıcı oranı ve %10 gliseroldür. Bazı SSCP’ler için yüksek yüzdeli jellerin kullanılması önerilmiştir. TEMED ve APS ile polimerize edilmiş, akrilamid benzeri hidrolink isimli jelin tek bir tipte gözenek büyüklüğüne sahip olduğu ve akrilamidden daha iyi rezolüsyon sağladığı belirtilmiştir. Yüksek rezolüsyon için ticari olarak bir çok özel jel matriksleri mevcuttur.

Şimdiye kadar rapor edilmiş jel uzunlukları 5-50 cm arasında değişmektedir. SSCP analizinde sonuçlar görsel değerlendirildiğinden iyi bir rezolüsyonun sağlanabilmesi için jelin boyutlarının uzun olması (yaklaşık 30x40 cm), elektroforez işlemlerinin düşük voltajda, uzun sürede yapılması ve ince bir jelin kullanılması gereklidir. Son yıllarda yapılan bir çok uygulamada standart sekans jelleri yerine mini jeller kullanılmıştır. Kısa jellerde keskin bant farklılıklarının gözlendiği bildirildiği halde %0,5 lik kayma farklılığının gözlenebilmesi için uzun elektroforezler tercih edilmelidir.

SSCP analizi için PCR ürünlerinin temiz ve spesifik olması gereklidir. Spesifik olmayan PCR ürünleri, kullanılmamış primerlerin varlığı, PCR siklus sayısının fazlalığı yanlış yorumlanabilecek bantlara neden olabilir. Genel olarak PCR ürünleri 96 oC de ısıtılarak denatüre edilir. Tek zincir haline gelmiş DNA lar hemen buz üzerine alınır ve hızla jele uygulanır. Örneğe güçlü denatüranların eklenmesi veya örneklerin 10-30 kat seyreltilmesi tek zincirlerin kendi kendine çift zincir oluşturmalarını en aza indirir. Denatüran olarak formamid, sodyum hidroksit, üre ve metil merkürik hidroksit kullanılabilir. Metil merkürik hidroksit toksiktir ama en etkili denatürandır. Özellikle ince jeller kullanıldığında denatüre edilmiş dilüe PCR ürünleri jele uygulandıkları noktada konsantre olurlar ve bir miktar renatürasyon gerçekleşir. Bu nedenle her zaman çift zincir DNA bantları tek zincir DNA bantlarından daha güçlü gözlenir.

daha iyi gözlenebilmesi için DNA'nın mümkün olduğunca sulandırılması gerekir. İnce jeller kullanıldığında tek zincir DNA'ların gözlenmesinde radyoaktif işaretleme, gümüş boyama ve etidyum bromide üstünlük sağlar.
Mutasyonun tipi ve bulunduğu yer SSCP analizinin duyarlılığını etkilemektedir. Mutasyon ikincil yapıya katılıyorsa SSCP analizinde mutasyon kolaylıkla saptanabilecektir. Eğer mutasyonun ikincil yapıyı oluşturmada rolü yoksa, mutasyon saptanmayabilir. Pürin içeriğinin daha fazla olduğu DNA tek zinciri jelde daha hızlı yürümekte ve daha belirgin değişiklikler göstermektedir. Guaninin Timine transversiyonu haricinde herhangi tip baz değişikliğinin sensitivite üzerine belirgin etkisi yoktur. Bir dizide heterozigot olarak bir değişim bulunuyorsa, bu dizinin SSCP analizi sonucunda dört farklı tek zincir DNA bandı oluşumu beklenir. Bunlar; normal allelin anlamlı ve anlamsız dizileri, ve mutant allelin anlamlı ve anlamsız dizileridir.SSCP analizi özel bir ekipmana ihtiyaç göstermeyen bir yöntem olduğu için basit ve hızlı bir tarama yöntemidir. SSCP analizinde mobilite farklılıkları görsel olarak değerlendirilir. Bu yüzden standardizasyonu kısıtlı ve otomasyona geçirilmesi de zordur. Optimal koşullar büyük oranda ampirik olarak tanımlanmıştır. Bir fragmanın farklı koşullarda analiz edilmesi mutasyonların tespit edilebilme olasılığını arttırır

Delesyon ve İnsersiyon Nedir

Delesyon ve İnsersiyon Nedir

Çerçeve Kayması Mutasyonları (frameshift mutation)

Delesyon veya insersiyonlar sadece birkaç baz çiftini kapsayabilirler. DNA zincirine katılan veya zincirden ayrılan bazların sayısı 3’ün katları olmadığında kodlama dizisindeki mutasyon, translasyondaki okuma çerçevesini mutasyonun olduğu noktadan itibaren karboksil ucuna kadar değiştirir. Bu tip mutasyonlar çerçeve kayması mutasyonları olarak adlandırılır. Bu mutasyonlar peptit zincirinin aminoasit dizisini büyük ölçüde değiştirmekle birlikte zincirin erken aşamada sonlanmasına da neden olabilir. Üç veya üçün katları şeklinde olan delesyon ve insersiyonlar ise yalnız mutasyonun olduğu bölgede aminoasit kaybına veya ilavesine neden olarak peptit zincirinin bir kısmını etkiler. Özellikle insersiyonlar önemli çerçeve kayması mutasyonlarına neden olur.

Büyük Delesyon ve İnsersiyonlar

Bir genin tamamını veya ardışık olan bir grup geni etkileyen delesyon veya insersiyonlardır. Büyük delesyonlar bir genin kodlayan kısmının tamamını ortadan kaldırabilir ve iki genin birleşerek füzyon protein oluşturmasına neden olabilir.

Trinükleotid Tekrar Artışları

Trinükleotid tekrar dizilerindeki tekrar sayılarının artması ile karakterize mutasyon mekanizmasıdır. Bu tür mutasyonların hastalığa neden olma mekanizmaları tam olarak bilinmemekle birlikte transkripsiyonu engellediği veya fonksiyonunu kaybetmiş proteinlerin sentezlenmesine neden olduğu ifade edilmiştir. Fragile-X sendromu, Kennedy’s ve Huntigton hastalığı gibi kalıtsal hastalıklar trinükleotid tekrarların artışı sonucu ortaya çıkmaktadır

Tek Gen ve Nokta Mutasyonu

Tek Gen Mutasyonları

Tek gen mutasyonu, bir gen içerisindeki DNA sekansının daimi değişimi ile oluşur ve bu değişiklik bir veya birden fazla nükleotidin bu sekansa ilave edilmesi veya çıkarılması ile gerçekleşir. Nokta mutasyon (point mutation), DNA’da tek bir baz çiftinin değişmesi ile oluşan mutasyondur. Bunun yanı sıra mutasyonlar bir veya daha fazla baz çiftinin artması ve azalması yani insersiyon ve delesyon olayları ile de gerçekleşebilir. Trinükleotid tekrar artışları da yine genetik hastalıklara sebebiyet verebilen değişikliklerdir.

Nokta Mutasyonları

Nokta mutasyonları aynı zamanda baz substitüsyonu olarak da adlandırılmaktadır. Yer değiştirme olayına katılan bazlar dikkate alındığında, bir pirimidin bazının diğer bir pirimidinle (C↔T) veya pürin bazının diğer bir pürinle (A↔G) yer değiştirmesi olayı transisyon olarak ifade edilmektedir. Bu tip mutasyonlar transversiyon olarak adlandırılan ve bir pürin bazı ile bir pirimidin bazının yer değiştirmesini ifade eden mutasyonlardan daha yaygın görülürler.
Bir yapısal genin kodlama bölgesinde oluşan herhangi bir mutasyon bu gen tarafından kodlanan polipeptid zincirindeki aminoasit sekansı üzerinde değişik etkiler meydana getirir. Nokta mutasyonları, genlerin fonksiyonlarını engelleme veya ürünün fonksiyonunu bozma mekanizmalarına göre dört gruba ayrılır.

Sessiz Mutasyonlar (silent mutation)

Baz dizisindeki her nükleotid değişimi kodlanan protein üzerinde bir aminoasit değişimine neden olmaz. Bu tip mutasyonlarda değişikliğe uğrayan baz çifti yine aynı aminoaside karşılık gelen farklı bir kodonun oluşmasına neden olur ve sonuçta aminoasit sekansı değişmeden kalır. Sessiz mutasyonlar kodlama bölgelerindeki mutasyonların %23’üne karşılık gelmektedir.

Yanlış Anlamlı Mutasyonlar (missense mutation)

DNA dizisindeki tek bir nükleotid değişikliği bazların triplet yapısındaki kodu değiştirerek gen ürününde bir aminoasidin yerine diğerinin geçmesine neden olur. Bu tip mutasyonlar genin kodlanan bölümünde anlam değişikliğine yol açarak farklı bir aminoasidin polipeptid zincirinde yer almasına neden olur. Yanlış anlamlı mutasyonlar kodlama bölgelerindeki mutasyonların %73’ünü oluşturur.

Anlamsız Mutasyonlar (nonsense, chain termination mutation)

Normalde mRNA’nın translasyonu terminasyon kodonlarından (UAG, UGA ve UAA) birine ulaşıldığında biter. Terminasyon kodonu oluşturan mutasyonlar translasyonun prematüre olarak tamamlanmasına, terminasyon kodonunu ortadan kaldıran mutasyonlar ise translasyonun bir sonraki terminasyon kodonuna kadar devam etmesine neden olurlar. Eğer bir mutasyon üç “stop” kodonundan herhangi birinin oluşmasına neden oluyorsa anlamsız mutasyon olarak ifade edilir. Genelde bu mutasyonların transkripsiyon üzerine etkisi yoktur fakat kesilmiş translasyon ürünü şekil ve fonksiyonel olarak anormal ve aynı zamanda da dayanıksız olur. Anlamsız mutasyonlar kodlama bölgelerindeki mutasyonların %4’ünü teşkil eder.

RNA Splays Mutasyonları (RNA splicing mutation)

Transkripsiyon sonucunda sentezlenen işlenmemiş RNA “heterojen nuklear RNA (hnRNA)” olarak tanımlanır. RNA splicing mekanizması, hnRNA’dan intronların çıkarılarak ekzonların bir araya gelip bağlanmasıyla mRNA’nın oluşturulması şeklinde gerçekleşir. Bu olayda intron/ekzon (akseptör tarafı) ve ekzon/intron (donor tarafı) hududunda spesifik nükleotid dizileri görev alır. RNA işlenmesi mutasyonları sonucunda alternatif donor veya akseptör taraflar ortaya çıkar ve bunlar RNA’nın işlenmesinde normal bölgelerle yarışırlar.