Restriksiyon Enzim Analizi

Restriksiyon Enzim Analizi

Restriksiyon endonükleazlar (RE), kısa DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen enzimlerdir. Farklı mikroorganizmalardan elde edilip; DNA üzerinde aynı diziyi tanıyıp kesim yapan enzimlere izosizomerler denir. MspI enzimi bu tür enzimlerdendir. Son zamanlarda adenovirus serotiplerinin ayırımında DNA üzerinde belli tanıma ve kesme bölgeleri olan RE analizi kullanılmaktadır. Bu yeni metodla daha önce ara tipler olarak tanımlanan suşların yeni bir alt grup olarak sınıflandırılmaları sağlanmıştır. AdV tip 43 – 49 ve AdV 50 ve 51 bu yöntem sayesinde belirlenebilmiştir (Richmond et al. 1988, Echavarria et al. 1999). Adenovirusların hızlı tiplendirilmesi için kullanılan PZR-RE kesimi kombinasyonu ile 51 adenovirus serotipini ve 1, 3, 4, 5, 7, 11, 19, 40 ve 41’e ait 44 farklı varyantı saptamak mümkün olmuştur. Ayrıca fiber gen bölgesinden seçilen primerler kullanılarak geliştirilen yeni bir PZR yöntemiyle A-F arası adenovirus türlerini tek bir amplifikasyon reaksiyonuyla tanımlamak mümkün olmuştur (Xu et al. 2000).

Genomik yapı ve genetik dizilim virüs aileleri, tipleri ve türleri arasında farklılık göstermektedir. Bu farklılığı DNA’nın RE’lerle kesimi sonrası ortaya çıkarmak mümkün olmaktadır. Aynı RE ile farklı DNA’ların kesilmesinde birbirinden farklı uzunlukta parça profili oluşmaktadır. Nükleik asit tabanlı tiplendirme sistemlerinde (RFLP, PFGE gibi) bu yaklaşım sıklıkla kullanılmaktadır ve moleküler tiplendirmenin en etkili yöntemlerinden biri olarak kabul edilmektedir ( Pingoud et al. 1993). Uygun RE’nin seçilmesinde bazı kriterler mevcuttur. Kesimden sonra ortaya çıkan parça uzunluğu analiz için uygun olmalıdır. En iyi sonuçlar 1-15 kb arasında olan parçalardan alınmaktadır. Ayrıca kesim sonunda analizi mümkün kılacak kadar parça oluşmalıdır

Adenovirusların Oluşturduğu Hastalıklar ve Klinik Bulgular

Adenovirus enfeksiyonlarını dört ana başlık altında toplamak mümkündür.

Solunum yolu enfeksiyonları

Adenoviruslarla ilişkili sendromların çoğunluğu solunum sistemini kapsamaktadır. Bunların önemli bir kısmı burun tıkanıklığı, burun akıntısı ve hafif farenjit veya trakeit şeklinde seyreder (Xu and Erdman 2001). Akut febril farenjit sıklıkla küçük çocuklarda görülür (Kajon et al. 1990). Ateş, öksürük, nazal konjesyon, koriza, boğaz ağrısı vardır (Hierholzer 1995). Diğer viral enfeksiyonlardan ve streptokokkal farenjitten ayırt edilmesi güçtür. AdV tip 1, 2, 3, 5 ve 7 bu hastalığa neden olmaktadır. Eğer hastalarda üst solunum yolu şikayetlerine ek olarak konjunktivit de gelişirse hastalık faringokonjunktival ateş olarak tarif edilir ve genellikle okul çağındaki çocuklarda sık görülür (Inagawa et al. 2001). Akut solunum hastalığı akut trakeobronşit ve pnönomi ile karakterize edilir (Teng 1960). Özellikle kalabalık ve yoğun yaşamın olduğu askeri birliklerde epidemiler şeklinde ortaya çıkar (Echavarria et al. 2003). AdV tip 4 ve 7 bu hastalığa neden olmaktadır (Blasiole et al. 2004).

Göz enfeksiyonları

Akut folliküler konjunktivit, çok bulaşıcı olup AdV tip 11 tarafından oluşturulur ve klamidyaların neden olduğu konjunktivite benzer (Inagawa et al. 1996, Ariga et al. 2004). Çocuklar ve genç erişkinlerde yüzme havuzundan veya küçük göllerden bulaş sonucu da konjunktivit gelişebilir. Konjunktivitin bu şekline epidemik keratokonjunktivit (EKC) adı verilir (Cooper et al. 1999, Uchio et al. 2002, Ariga et al.

2005, Ishiko et al. 2008, Aoki et al. 2008). Gemi yapım tezgahlarında çalışanların toz, travma ve durgun su ile karşı kaşıya olmaları EKC’in bu bireylerde de sık gelişmesine neden olmaktadır. Hastalık göz kapaklarında ödem, ağrı, fotofobi ile seyreden bilateral folliküler konjunktivit şeklindedir. AdV tip 8, 19, ve 37 bu hastalığa yol açar.

Jin et al. (2006) konjuktival sürüntü örneklerini gerçek zamanlı PZR yöntemiyle çalışmış ve tespit edilen adenovirusların tip tayinini yaptığında, AdV 3, 8 ve 37 bulunmuştur.

Adenovirus Genel Özellikleri

Adenovirusların Genel Özellikleri

Adenoviruslar çift iplikli DNA içeren, orta büyüklükte (65-75 nm), çıplak virüslerdir. Viriyonun DNA ve ilişkili proteinler içeren özyapısı 252 kapsomerden oluşan ikozahedral bir kapsidle çevrilidir. İkozahedron 20 eşkenar yüzü ve 12 köşesi olan bir polihedrondur. Adenoviruslar ikozahedral virüslere örnek olarak verilebilirler

Toplam kapsomer sayısı 252’dir. Bunun 12’si penton (köşelerde yer alan kapsomerler), 240’ı hekzondur (yüzeyde yer alan kapsomerler). İkozahedral kapsidin eşkenar üçgen yüzünde yer alan her kapsomer 6 komşu kapsomerle çevrilidir ve hekzon adını alır. Köşelerde bulunan kapsomerlerin herbiri 5 komşu kapsomerle çevrilidir ve penton adını alır. Bir ikozahedral yapıda 12 köşe olduğuna göre total kapsomer sayısı ne olursa olsun daima 12 penton bulunur. Penton kapsomeri 2 yapısal kısımdan oluşur. Bunlardan köşede bulunan kapsomer alt yapısı “penton baz” ve bunlardan çıkan uzantı “fiber” olarak adlandırılır

Fiber antijeninin uzunluğu tiplere göre farklılık gösterir. Adenovirusların nötralizasyon testi ile tiplere ayrılmasında anti-fiber antikorlarının rolü büyüktür. Penton antijeni virüslerin hücre kültürlerinde oluşturduğu erken sitopatik etkiden (CPE) sorumludur ( Fields et al. 1996).
Hekzon antijeninde iki önemli antijenik determinant saptanmıştır. Bunlardan birisi tipe özgüllüğü belirlemekte, diğeri ise tipler arasındaki çapraz reaksiyonları ortaya çıkarmaktadır (
http://www-micro.msb.le.ac.uk/default.html:Virology:Adenoviruses, 2005).
Adenovirus taneciklerinin ayrıntılı olarak üç boyutlu yapısal modelleri, kriyoelektron mikroskobisi ve x-ray kristallografi kombinasyonlarına dayanılarak yapılmıştır. Buna göre, adenovirus kapsidinde en fazla 10 protein vardır (Stewart et al. 1991)

Genom

Doğrusal, segmentsiz, çift iplikli DNA, gruptan gruba değişmekle birlikte 30-38 kb büyüklüğündedir. Adenovirus yapısının %13’ü DNA, %87’si proteindir (Green and Pina 1963, Ishibashi and Maizel 1974, Şimşek 1993). Genom yapısı grup içinde virüslerin tespitinde kullanılan karakterlerden biridir (Harrington et al. 2004).

Replikasyon

Bütün adenovirusların replikasyonu benzerdir ve çekirdekte meydana gelir. Çünkü çift iplikli DNA virüslerinden olan Adenoviridae ailesinin üyeleri replikasyon ve transkripsiyon için hücresel faktörlere gerek duyarlar. Bu faktörler arasında DNA polimeraz ve RNA polimeraz II gibi replikaz ve transkriptazlar yer alır. Bu enzimler hücre çekirdeğinde bulunduğundan adenoviruslar da hücre çekirdeğinde replike olurlar.

Adenoviruslar kendi DNA polimerazlarını kodlarlar, ancak, RNA polimerazları olmadığından çekirdekteki transkripsiyon donanımlarını kullanmak zorundadırlar