DNA Metilasyonu
Kromatin konformasyonundaki değişiklikler, gen ifadesinin düzenlenmesine yardım eden yollardan biridir. Gen ifadesinin düzenlenmesinde rol oynayan diğer bir önemli olay ise, DNA bazlarına metil grubunun eklenmesi ya da bu bazlardan metil grubunun ç›karılmasıyla ortaya çıkan kimyasal bir değişikliktir (Kass et al 1997). Birçok ökaryotik organizmanın DNA’sı, metil gruplarının enzim (DNA metiltransferaz) aracılığıyla bazlara eklenmesiyle replikasyondan sonra değiştirilir. Metillenme, DNA’daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden ve genellikle de her iki zincirde birden olur. Metilasyon, DNA dizisindeki guaninin önünde yerleşmiş sitozinlerin (CpG) 5. konumundaki karbonuna metil grubu bağlanması ile gerçekleşmekte ve bölgesel hipermetilasyon, promotor bölgede (gen ifadesini başlatan bölge) bulunan CpG adacıklarını etkileyerek genin aktivitesini durdurmaktadır. CpG adacıkları, sıklıkla promotor bölgeleri olarak işlev görürler ve ayrıca replikasyon başlangıç bölgeleri oldukları düşünülmektedir (Delgado et al 1998)
DNA Metilasyon
Metillenmenin gen ifadesinin düzenlenmesindeki rolü ile ilgili en kuvvetli bulgular baz anologları ile yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. Bir baz anoloğu olan 5’-azasitidin nükleotiti, DNA’da sitozinin yerine girer ve bu molekül kimyasal olarak metillenemediği için, girdiği bölgelerde DNA’nın metillenmesi engellenir. 5’-azasitidinin DNA’ya katılması, gen ifadesi olayını değiştirir ve inaktif X kromozomu üzerindeki allellerin ifadesi uyarılır (Bird 2002).
DNA metilasyonu, DNA metil modifikasyon sistemi olarak adlandırılır. DNA metil transferaz enzimi tarafından genel bir metil donörü olarak bilinen S-adenozil metioninden bir metil grubunun alınıp transfer edilmesi esasına dayanır. Memeli hücrelerinde modifiye sitozin (5’-mC) %90 oranında CpG dinükleotid yapısında bulunur ve episitozin olarak adlandırılır. Episitozin denilmesinin sebebi epigenetik kalıtımda rol almasındandır. Özellikle somatik hücrelerde gen işlevleri üzerinde önemli etkiye sahiptir (Egger 2004).
DNA metilasyon değişiklikleri genellikle CpG (Sitozin fosfo Guanin) dinükleotidlerinde meydana gelir. CpG dinükleotidleri genellikle hedef noktalarıdır ve 1–2 kb uzunluğundadır. CpG adaları olarak adlandırılır. Genin içinde ya da genin promotor bölgesi yakınında ve genlerin 1.ekzon bölgelerinde yer alırlar. CpG adalarının genomda görülme sıklığı %5–10 arasındadır. Memelilerde metilasyon semi-konservatif şekilde kalıtılır. DNA metilasyonu 1948 yılında Hotchkiss tarafından ilk olarak keşfedilen epigenetik marker olmuştur (Patel 2003).
DNA Metilasyonu ile Gen İfadesinin Düzenlenmesi
Birçok ökaryotik organizmanın DNA’sı metil gruplarının enzim aracılığı ile bazlara ve şekerlere eklenmesi yoluyla, replikasyondan sonra değiştirilir yani post sentetik modifikasyondur (Cooper 1983). Bazların metillenmesi genellikle sitozinden olur ve belirli herhangi bir ökaryotik organizmanın sitozinlerinin yaklaşık %5’i metillenir. Ancak, metilasyon derecesi dokuya özgüdür ve %2’den %7’nin üzerine çıkacak şekilde değişiklik gösterir. Baz metilasyonunun gen ifadesini değiştirdiğinin ortaya çıkarılması, E.coli’nin lac operonu ile yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur. Operatör bölgedeki
DNA’daki tek bir sitozinin metillenmesi bile, reseptörün operatöre olan ilgisinde fark edilebilir bir değişiklik meydana getirebilir. Sitozin 5’ucundan metillenir, böylece metil grubu DNA sarmalının büyük oluğundan dışarı çıkıntı yapar ve proteinlerin DNA’ya bağlanmasını etkiler. Metillenme, genellikle DNA’daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden ve genellikle de her iki zincirde birden olur (Michalowsky 1989).
Epigenetik Nedir
Epigenetik terimi ilk kez 1942 yılında Condrad Waddinton tarafından genler arası etkileşimde çevresel faktörlerin fenotipte kendini göstermesi olarak kullanılmıştır. Gen ekspresyonuna dayanan kalıtsal bilgi epigenetik olarak sınıflandırılır. Bu, genetik bilginin aksine gen dizisi ile ilişkili değildir. Başka bir deyişle, gen fonksiyonlarında meydana gelen mitotik, mayotik, kalıtsal değişimlerdir ve DNA dizisinde meydana gelen değişimlerle açıklanamazlar
Epigenetik ilke
Yetişkin dönem kalıtımı ya da somatik hücre kalıtımı olarak da tanımlanabilir. Hücreler gen ifade kontrolünü nükleozomları kullanarak yaparlar. Nükleozomlar, DNA’nın globüler histon proteinleri etrafında sarılarak oluşturdukları eskiden kromomer olarak bilinen yapılardır. Nükleozomlar kromatin denilen yapıyı oluştururlar. Kromatin yapısındaki değişiklikler gen ifadesini kontrol eder. Kromatinin sıkılaşıp yo ğunlaşmış halde inaktif iken (heterokromatin), gevşek hali (eukromatin) ise aktiftir (Jenuwein 2001).
Kromatinin yapısındaki bu dinamik durum ise geri dönüştürülebilir olan, DNA metilasyonu ya da histon modifikasyonları ile sağlanan epigenetik paternler ile değiştirilir. Bu işlemlerde görevli olan enzimler arasında DNA metiltransferazlar (DNMT), histon deasetilazlar (HDAC), histon asetilazlar (HAC), histon metil transferazlar ve metil binding protein MECP2 sayılabilir. Epigenetik değişimler genlerin sessizleşmesine (silencing) neden olurlar. Bu da geni inaktive edici bir mutasyon veya delesyon gibi genetik bir mekanizmayla eşdeğerdir. Ancak epigenetik değişimler geri dönüşümlü oluşları ve DNA’nın baz dizisinde bir değişime neden olmamaları gibi özellikleriyle genetik değişimlerden ayrılırlar (Jones et al 2002).
Epigenetik Mekanizmalarla Sessizleştirilen Genler (epigenetik ppt)
DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu birlikte, epigenetik regülasyonda, genomik imprinting, X inaktivasyonu ve genomun yeniden programlanmasında görev alırlar ve transkripsiyel faktör olarak epigenetik mekanizmada görev yaparlar. Tümörlerde genler sıklıkla metilasyon tarafından sessizleştirilirler.
Hücre siklusunda etkili olan genler; RB1, p16INK 4a, p15INK4b (lösemi), p14 ARF (kolon, mide)
Sinyal iletiminde etkili olan genler; APC, LKB1/STK11, RASSF1
Apoptosisde etkili olan genler; DAPK (lenfoma), caspase–8
DNA tamirinde etkili olan genler; MGMT (beyin, akciğer, kolon ca. , lenfoma), BRCA1 (meme, over ca.), MLH1 (kolon, mide, endometriyum ca.),
Karsinojen metabolizmasında etkili olan genler; GSTP1 (meme, karaciğer, böbrek, prostat ca.),
Hormonal cevapda etkili olan genler; ER, PR RAR (kolon, akciğer, meme, lenfoma)
Metastazda etkili olan genler; E-cadherin, VHL olarak gösterilmiştir (Esteller 2002).
Histon modifikasyonları
Histon asetilasyonu / deasetilasyonu
Histon metilasyonu
Serin veya treoninlerin fosforilasyonu
Glutamik asitlerin ADP-ribozilasyonu
Histon ubiquitinasyonu olarak ifade edilmiştir.
Tüm bu mekanizmalar, kromatin yapısında değişiklikler oluşturarak transkripsiyonu düzenleyici komplekslerin DNA’ya ulaşabilirliğini etkilerler. Ayr ıca birçok histon modifikasyonu geri dönüşümlüdür ve modifikasyon seviyesi ile transkripsiyon seviyesi sıkı ilişki içerisindedir. Histon proteinleri DNA’nın paketlenmesinde görev alırken, nükleozomdan dışarıya çıkıntı yapan bazik NH2 (amino) terminal uçları bir takım post-translasyonel modifikasyonlara uğrayabilir. Bu modifikasyonlar arasında; HAT (histon asetil transferaz)’lar tarafından asetillenme ve HMT (histon metil transferaz)’lar tarafından metillenme yer almaktadır (Jones et al 2002).
Nor Bölgeleri Genel Özellikleri
Çekirdekçik oluşturan bölgeler(NOR’lar), insanda bulunan 5 çift akrosentrik kromozomların yani 13, 14, 15, 21 ve 22. kromozom çiftlerinin ikincil boğumu olarak nitelendirilen satellit saplarında bulunan ribozomal DNA’ları (rDNA) ifade ederler . NOR’lar, rDNA’nın çok sayıda kopyalarını içeren kromozomal bölgeler olup NOR başına rDNA kopyalarının sayısı farklıdır. rDNA yüksek miktarda guanin ve sitozin içeriğine sahiptir.
rDNA, transkripsiyonel olarak hepsinde aktif olmasa da kısa kollarını yitirmemiş tüm insan akrosentrik kromozomlarında bulunur. Marsupial PtK1 hücrelerinde eğer ki bir NOR, transkripsiyonel olarak aktif değilse, genellikle fakültatif heterokromatin durumda bulunduğu ileri sürülmektedir. Transkripsiyonel olarak aktif olan NOR’lar inaktif olan NOR’lardan belirli bir uzaklıkta bulunurlar. Çekirdekçik içinde bulunan rDNA, transkripsiyonel olarak aktiftir).
1961’den beri, insanda 10 akrosentrik kromozomun kısa kollarının saplar taşıdığı ve yumru şeklinde satellitleri olduğu kabul edilmektedir. Bu bölgeler çekirdekçiğin yapımında işe karıştıkları için, sitogenetik açıdan öneme sahiptirler.
İnsan hücrelerinin metafazlarında, NOR taşıyan akrosentik kromozomların kısa kolları sık sık bir arada bulunurlar buna satellit birleşmesi (Satellite Association) denir. Daha fazla miktarda RNA içeren NOR’ların daha sık olarak satellit birleşmelerine katıldıkları ve yine aynı şekilde aktif NOR’ların inaktif olanlardan çok daha fazla sıklıkta bu birleşmelere katıldıkları ileri sürülmüştür.
NOR PROTEİNLERİ
NOR proteinlerinin gümüşe, belirli ilgileri vardır. Asidik şartlar altında birçok hücresel protein boyanmadan kalırken, NOR proteinleri, bu koşullarda gümüşü indirgeme yetenekleri sayesinde boyanırlar ve diğer hücresel proteinlerden ayırt edilmeleri sağlanır.
NOR proteinleri, aktif ribozomal genlerin bir göstergesi sayılırlar. Gümüş boyama ile ortaya çıkarılan AgNOR proteinlerinin miktarının, transkripsiyonel aktivite ve hücre çoğalması ile doğrudan ilişkili olduğu ileri sürülmektedir
Aktif transkripsiyon ve çoğalma sırasında tanımlanan ana AgNOR proteinleri, protein B23 ve nükleolinlerdir.
Nükleonin; insan hücrelerinde 105kDal ağırlığında bir fosfoproteindir. rRNA moleküllerinin transkripsiyonunda önemli rol oynar. %5’den daha az miktarı mitoz sırasında ribozomal genlerle bağlı kalır. Nükleonin yapısal bir fonksiyona da sahiptir
Protein B23; 38–39 kDal ağırlığında bir fosfoproteindir. Daha çok sitoplazmada bulunur. Öncül ribozomal parçaların organizasyonunun son aşamasında görev alırlar
AgNOR proteinleri, elektron mikroskobu ile özellikle çekirdekçiğin ipliksi merkez ve yoğun ipliksi bölgelerinde bulunurlar. İnterfaz çekirdeğinde granüllü bölgeden dışarı atılırlar. Farklı miktarlardaki AgNOR proteinleri ince bir flament ile oluşan granüllere bağlanırlar.
AgNOR proteinlerinin, düzenli olarak hücre çoğalması ve nükleolar aktiviteyi değerlendirmek için kullanıldığı ve kanser hücresinin erken tanısı için bir ölçüt olduğu belirtilmektedir. Ökaryot hücreler rRNA sentezini hızlı bir şekilde düzenleyen mekanizmaya sahiptirler. Bu düzenleme, memeli hücreleri temel aminoasitlere ihtiyaç duyduğu zaman gözlenir ve mekanizmanın kontrolüne ribonükleoproteinler katılmaktadır
NOR‘LARIN GÜMÜŞ NİTRAT İLE BOYANMASI
İnterfaz ya da mitoz sırasında transkripsiyonel olarak aktif olan NOR’ların yerleşimi gümüş boyama ile gösterilebilmektedir. Ribozomal genlerin aktif transkripsiyonel bölgesi ile gümüş boyanırlılığı arasında doğrudan ilişki vardır. Ancak mitotik NOR’ların gümüşle boyanabilmesi için NOR, kromatinin hücre döngüsünün bir önceki interfazında transkripsiyonel aktif olması gerektiği ileri sürülmektedir
Gümüş nitrat, 1880’li yılların sonlarından beri sitolojik bir boya olarak kullanılmaktadır. Kromozom preparatlarında AgNOR boyama ilk olarak 1920 yılında Carleton tarafından gösterilmiştir (19). Sitogenetik preparatlara AgNOR boyama tekniği, 1975 yılında Goodpasture ve Bloom tarafından çekirdekçik oluşturan bölgeleri ortaya çıkarmak amacı ile geliştirilmiştir. Bu teknik, 1980’de Howell ve Black tarafından basitleştirilerek ışık ve elektron mikroskobu alanlarında uygulanmıştır.
Gümüş boyama tekniği, asidik bir ortamda gümüş nitratın NOR proteinleri tarafından metalik gümüşe indirgenmesine dayanır. NOR boyama DNAaz ya da RNAaz‘lardan etkilenmezken, pronaz, tripsin ya da papain gibi proteolitik enzimlerden etkilenmektedir. Buda bize gümüş nitratı metalik gümüşe indirgeyen asıl maddenin DNA ya da RNA olmayıp bu bölgelere NOR proteinleri olduğunu gösterir. Gümüş boyanmaya neden olan materyalin, interfaz boyunca üretildiği ve profazda NOR’ların etrafında biriktiği ileri sürülmektedir
Çekirdek ekstraktlarından elde edilen jel elektroforezinde gümüşe bağlanan proteinlerin bir kısmı gösterilmiştir. Gümüşe proteinlerin bağlanma reaksiyonu sülfidril grupları vasıtasıyla meydana geliyor gibi görülmektedir. rDNA’lar transkripsiyonunu katalizleyen RNAP- I bu şekilde tanımlanan ilk proteindir.
Fosfat grupları da gümüş boyamada işe karışabilmektedir. Gümüşe bağlanan nükleolin (C23) ve B23 iki majör AgNOR proteinleridir. C23 ve B23 çekirdekçiğin fosforile edilen ana asidik fosfoproteinleridir. Bu proteinlerin küçük birimleri olan fosfoserin ve fosfotrionin gümüş boyamada işe karışabilmektedir. Bunun yanı sıra nükleolinin amino terminal bölgesindeki asidik amino asitlerin konsantrasyonu, gümüş iyonlarının indirgenmesinden sorumludur.
