Multipleks Ligasyon Esaslı Prob Amplifikasyonuu (MLPA Nedir)
Multipleks ligasyon esaslı prob amplifikasyonu (MLPA), basit bir reaksiyonda 45’ e yakın nükleik asit dizisindeki kopya sayısı değişikliklerini tespit eden bir metottur. MLPA tekniği, genomik DNA analizinde kullanıldığı gibi, mRNA’da da kullanılabilir. CpG metilasyonunun multipleks ölçümünde yarı kantitatif olarak kullanılmaktadır. Çeşitli genlerde amplifikasyon ve delesyonların tespiti amacıyla MLPA tekniği, multipleks bir PCR ile 45 farklı spesifik dizilimin aynı anda ölçülmesine olanak sağlamaktadır.
Amplifikasyon ürünleri, sekans türü elektroforezler tarafından fragman analizi yapılarak ayırdedilmektedir. 130 ile 490 bp’ e kadar fragment sayısı ile, tekrar tekrar kopyalanabilirliği çok yüksek olan jel şablonu elde edilen teknikte, sadece 1 çift PCR primeri kullanılır. Bir kontrolden elde edilen ile bu jel şablonunun karşılaştırılması, hangi dizilerin tipik olmayan kopya sayıları gösterdiğini belirtmektedir. 45 farklı dizilimi hedefleyen MLPA reaksiyonu, sadece 20 ng insan DNA’sı gerektirir ve sadece bir nükleotitteki farklılığı içeren dizilimleri ayırdedebilme potansiyeline sahiptir. BAC arrays ve FISH’ den farklı olarak, tesbit edilen dizilimler küçüktür (yaklaşık 60 nükleotit). Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, MLPA reaksiyonları hızlı ve kullanımı kolayd ır (MRC 2005).
DNA Metilasyonu
Kromatin konformasyonundaki değişiklikler, gen ifadesinin düzenlenmesine yardım eden yollardan biridir. Gen ifadesinin düzenlenmesinde rol oynayan diğer bir önemli olay ise, DNA bazlarına metil grubunun eklenmesi ya da bu bazlardan metil grubunun ç›karılmasıyla ortaya çıkan kimyasal bir değişikliktir (Kass et al 1997). Birçok ökaryotik organizmanın DNA’sı, metil gruplarının enzim (DNA metiltransferaz) aracılığıyla bazlara eklenmesiyle replikasyondan sonra değiştirilir. Metillenme, DNA’daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden ve genellikle de her iki zincirde birden olur. Metilasyon, DNA dizisindeki guaninin önünde yerleşmiş sitozinlerin (CpG) 5. konumundaki karbonuna metil grubu bağlanması ile gerçekleşmekte ve bölgesel hipermetilasyon, promotor bölgede (gen ifadesini başlatan bölge) bulunan CpG adacıklarını etkileyerek genin aktivitesini durdurmaktadır. CpG adacıkları, sıklıkla promotor bölgeleri olarak işlev görürler ve ayrıca replikasyon başlangıç bölgeleri oldukları düşünülmektedir (Delgado et al 1998)
DNA Metilasyon
Metillenmenin gen ifadesinin düzenlenmesindeki rolü ile ilgili en kuvvetli bulgular baz anologları ile yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. Bir baz anoloğu olan 5’-azasitidin nükleotiti, DNA’da sitozinin yerine girer ve bu molekül kimyasal olarak metillenemediği için, girdiği bölgelerde DNA’nın metillenmesi engellenir. 5’-azasitidinin DNA’ya katılması, gen ifadesi olayını değiştirir ve inaktif X kromozomu üzerindeki allellerin ifadesi uyarılır (Bird 2002).
DNA metilasyonu, DNA metil modifikasyon sistemi olarak adlandırılır. DNA metil transferaz enzimi tarafından genel bir metil donörü olarak bilinen S-adenozil metioninden bir metil grubunun alınıp transfer edilmesi esasına dayanır. Memeli hücrelerinde modifiye sitozin (5’-mC) %90 oranında CpG dinükleotid yapısında bulunur ve episitozin olarak adlandırılır. Episitozin denilmesinin sebebi epigenetik kalıtımda rol almasındandır. Özellikle somatik hücrelerde gen işlevleri üzerinde önemli etkiye sahiptir (Egger 2004).
DNA metilasyon değişiklikleri genellikle CpG (Sitozin fosfo Guanin) dinükleotidlerinde meydana gelir. CpG dinükleotidleri genellikle hedef noktalarıdır ve 1–2 kb uzunluğundadır. CpG adaları olarak adlandırılır. Genin içinde ya da genin promotor bölgesi yakınında ve genlerin 1.ekzon bölgelerinde yer alırlar. CpG adalarının genomda görülme sıklığı %5–10 arasındadır. Memelilerde metilasyon semi-konservatif şekilde kalıtılır. DNA metilasyonu 1948 yılında Hotchkiss tarafından ilk olarak keşfedilen epigenetik marker olmuştur (Patel 2003).
DNA Metilasyonu ile Gen İfadesinin Düzenlenmesi
Birçok ökaryotik organizmanın DNA’sı metil gruplarının enzim aracılığı ile bazlara ve şekerlere eklenmesi yoluyla, replikasyondan sonra değiştirilir yani post sentetik modifikasyondur (Cooper 1983). Bazların metillenmesi genellikle sitozinden olur ve belirli herhangi bir ökaryotik organizmanın sitozinlerinin yaklaşık %5’i metillenir. Ancak, metilasyon derecesi dokuya özgüdür ve %2’den %7’nin üzerine çıkacak şekilde değişiklik gösterir. Baz metilasyonunun gen ifadesini değiştirdiğinin ortaya çıkarılması, E.coli’nin lac operonu ile yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur. Operatör bölgedeki
DNA’daki tek bir sitozinin metillenmesi bile, reseptörün operatöre olan ilgisinde fark edilebilir bir değişiklik meydana getirebilir. Sitozin 5’ucundan metillenir, böylece metil grubu DNA sarmalının büyük oluğundan dışarı çıkıntı yapar ve proteinlerin DNA’ya bağlanmasını etkiler. Metillenme, genellikle DNA’daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden ve genellikle de her iki zincirde birden olur (Michalowsky 1989).
Epigenetik Nedir
Epigenetik terimi ilk kez 1942 yılında Condrad Waddinton tarafından genler arası etkileşimde çevresel faktörlerin fenotipte kendini göstermesi olarak kullanılmıştır. Gen ekspresyonuna dayanan kalıtsal bilgi epigenetik olarak sınıflandırılır. Bu, genetik bilginin aksine gen dizisi ile ilişkili değildir. Başka bir deyişle, gen fonksiyonlarında meydana gelen mitotik, mayotik, kalıtsal değişimlerdir ve DNA dizisinde meydana gelen değişimlerle açıklanamazlar
Epigenetik ilke
Yetişkin dönem kalıtımı ya da somatik hücre kalıtımı olarak da tanımlanabilir. Hücreler gen ifade kontrolünü nükleozomları kullanarak yaparlar. Nükleozomlar, DNA’nın globüler histon proteinleri etrafında sarılarak oluşturdukları eskiden kromomer olarak bilinen yapılardır. Nükleozomlar kromatin denilen yapıyı oluştururlar. Kromatin yapısındaki değişiklikler gen ifadesini kontrol eder. Kromatinin sıkılaşıp yo ğunlaşmış halde inaktif iken (heterokromatin), gevşek hali (eukromatin) ise aktiftir (Jenuwein 2001).
Kromatinin yapısındaki bu dinamik durum ise geri dönüştürülebilir olan, DNA metilasyonu ya da histon modifikasyonları ile sağlanan epigenetik paternler ile değiştirilir. Bu işlemlerde görevli olan enzimler arasında DNA metiltransferazlar (DNMT), histon deasetilazlar (HDAC), histon asetilazlar (HAC), histon metil transferazlar ve metil binding protein MECP2 sayılabilir. Epigenetik değişimler genlerin sessizleşmesine (silencing) neden olurlar. Bu da geni inaktive edici bir mutasyon veya delesyon gibi genetik bir mekanizmayla eşdeğerdir. Ancak epigenetik değişimler geri dönüşümlü oluşları ve DNA’nın baz dizisinde bir değişime neden olmamaları gibi özellikleriyle genetik değişimlerden ayrılırlar (Jones et al 2002).
Epigenetik Mekanizmalarla Sessizleştirilen Genler (epigenetik ppt)
DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu birlikte, epigenetik regülasyonda, genomik imprinting, X inaktivasyonu ve genomun yeniden programlanmasında görev alırlar ve transkripsiyel faktör olarak epigenetik mekanizmada görev yaparlar. Tümörlerde genler sıklıkla metilasyon tarafından sessizleştirilirler.
Hücre siklusunda etkili olan genler; RB1, p16INK 4a, p15INK4b (lösemi), p14 ARF (kolon, mide)
Sinyal iletiminde etkili olan genler; APC, LKB1/STK11, RASSF1
Apoptosisde etkili olan genler; DAPK (lenfoma), caspase–8
DNA tamirinde etkili olan genler; MGMT (beyin, akciğer, kolon ca. , lenfoma), BRCA1 (meme, over ca.), MLH1 (kolon, mide, endometriyum ca.),
Karsinojen metabolizmasında etkili olan genler; GSTP1 (meme, karaciğer, böbrek, prostat ca.),
Hormonal cevapda etkili olan genler; ER, PR RAR (kolon, akciğer, meme, lenfoma)
Metastazda etkili olan genler; E-cadherin, VHL olarak gösterilmiştir (Esteller 2002).
Histon modifikasyonları
Histon asetilasyonu / deasetilasyonu
Histon metilasyonu
Serin veya treoninlerin fosforilasyonu
Glutamik asitlerin ADP-ribozilasyonu
Histon ubiquitinasyonu olarak ifade edilmiştir.
Tüm bu mekanizmalar, kromatin yapısında değişiklikler oluşturarak transkripsiyonu düzenleyici komplekslerin DNA’ya ulaşabilirliğini etkilerler. Ayr ıca birçok histon modifikasyonu geri dönüşümlüdür ve modifikasyon seviyesi ile transkripsiyon seviyesi sıkı ilişki içerisindedir. Histon proteinleri DNA’nın paketlenmesinde görev alırken, nükleozomdan dışarıya çıkıntı yapan bazik NH2 (amino) terminal uçları bir takım post-translasyonel modifikasyonlara uğrayabilir. Bu modifikasyonlar arasında; HAT (histon asetil transferaz)’lar tarafından asetillenme ve HMT (histon metil transferaz)’lar tarafından metillenme yer almaktadır (Jones et al 2002).
