Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR, spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmsi olup invitro bir yöntemdir. Yöntem 1980’li yıllarda Cetus firması çalışanları tarafından geliştirilmişl olup, o günden bu güne kadar pek çok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır; Klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması, ve pek çok hastalığın DNA temeline dauyalı tanısını koymada. PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA parçalarının sentezi 1-2 saat içinde yapılabilmektedir. Tüm bu sebepler PCR tekniğinin moleküler tıpta yaygın kullanılmasına neden olmuştur.
Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli DNA molekülünden hedef dizilere iki oligonükleotit primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler , kalıp DNA molekülü yüksek sıçaklıkta denatüre edildikten sonra tek iplikli DNA molekülü üzerine uygun sıcaklıkta kendileri için kalıp olan bölgeye hibridize olurlar. Bu işlem düşük sıcaklıkta gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid (dNTP) varlığında primerlerin serbest 3’ hidroksil uçlarına kalıp diziye uygun olan bazları bağlar. Böylece kalıp ipliğe tamalayıcı yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsünde denatürasyon, primerlerin bağlanması (annealing) ve uzama (extension) olarak adlandırılan başlıca üç aşama vardır. Ardışık tekrarlar ile hedef DNA bölgesi istenilen miktarda çoğaltılabilir. Reaksiyonu gerçekleşmesi için ortamda bulunması gereken moleküller ve enzimleri şu şekilde sıralayabiliriz:
1. Kalıp DNA
2. DNA polimeraz enzimi
3. Primerler
4. Dört çeşit dNTP
5. MgCl2
6. Tampon
PCR Çeşitleri
Moleküler çalışmalarda kullanılan amaca yönelik birden fazla PCR çeşidi bulunmaktadır. Çalışılan DNA kaynağına ve hedef DNA bölgesine göre faklı yöntemler tercih edilebilir. Temelde ayni mekanizma kullanılmakla birlikte birbirlerinden faklılıuklraı bulunmaktadır. Bunların listesini vercek olursak;
1. Nested PCR (Yuvalanmış PCR)
2. Anchored PCR (Demirlenmiş PCR)
3. Revers Transkripsiyon PCR (RT-PCR, Geri PCR)
4. Asimetrik PCR
5. Inverse PCR (IPCR, Ters PCR)
6. In situ PCR
7. Multiplex PCR (Çoklu PCR)8. Rastgele Çoğaltılmış
Gebelikte Trombofili
Gebelik kayıplarında plasentasyon bozukluğu ve plesanta damar yapısında mikrotubuluslar dikkat çekici ölçüde artmış olarak tespit edilmiştir. Koagulasyon ve fibrinolitik yolların çoğu embriyonun plesantasyonu ve trofoblastların invazyonu sırasında görev yapar
Prokoagulan faktörlerin düzeyindeki artış, doğal antikoagulanların düzeyindeki azalma ve fibrinolizdeki azalma gebelikte hiperkoagulatatif durumun ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Gebelikte özellikle ovulasyon, implantasyon ve plasentasyon aşamasında hemostatik sistem çok önemlidir. Gebelikte hemostatik sistemde önemli değişiklikler olmakta ve bunun neticesinde hemostatik mekanizmalar trombus oluşmasına yatkın olan yeni bir dengeye kavuşmaktadır. Fetoplasental dolaşımın sağlıklı olması gebeliğin devamlılığında çok önemlidir. Hemostatik sistemdeki gebelik boyunca oluşan değişiklikler işte bu çok önemli olan fetoplasental dolaşımın gerçekleşmesini sağlar
Gebeliğin ikinci tremesterından itibaren Faktör VII, VIII, X ve fibrinojen düzeyleri yükselmeye başlarken bunları dengelemesi gereken antitrombin III, protein C ve S ise koagulanları dengeleyecek oranda artmaz. Protein S düzeyleri %40-50 oranlarında düşerken antitrombin III ve protein C düzeyleri sabit kalır (92). Plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) ve plasminojen aktivatör inhibitörü 2 düzeyleri gebelik boyunca sürekli artar. PAI-1 endotelyal hücreler tarafından salınır ve plasminojen aktivatörünü inhibe eder. PAI-2 ise trofoblastlar tarafından üretilir ve plasental gelişimi kontrol eder. Trombosit aktivasyonunda da belirgin artış görülür, tromboksan üretimindeki artış prostasiklinin antiagretuar etkisine karşı trombosit sensitivitesindeki azalma gebeliğin protrombik durumuna katkıda bulunur. Gebelikteki hemostatik değişiklikler koagulasyonu tetikler
İmplantasyonun kolaylaşmasında ürokinaz plazminojen aktivatörü (UPA) önemli bir ajandır. Maternal venöz sinüslerde bulunan UPA plazminin üretimini tetikler. Bu ajan gebeliklte birinci trimester boyunca eksprese edilir
Gebelikte trofoblast invazyonu plazminojen düzeyinin dengelenmesiyle direk bağlantılıdır. Trofoblast invazyon bozuluğu tekrarlayan gebelik kaybı olanlarda, preeklamsili ve IUGR’li gebelerin plasentalarından yapılan plasental yatak biopsilerinde gözlenmiştir.
Sağlıklı gebeliklerde plasentada hemostatik, fibrinolitik, protein C bağımlı antikoagulan (Faktör V Leiden) yolaklar mevcuttur ve bunlar hemostazın devamlılığını sağlarlar. Kayıpların olduğu gebeliklerde fibrinin plasental dağılımı da değişmiştir ve sitokinler gibi bazı faktörlerin üretimi normalde trombo-resistan olan endotelin trombojenik bir endotele dönüşmesine yol açar.
Tekraralayan gebelik kayıpları olan kadınlarda tromboxan artışı ve prostasiklin düşüşü olduğu bazı çalışmalarda tespit edilmiştir. Tromboksanın prostasiklin oranındaki bu kayma vazospazm ve trombosit agregasyonuna yol açmaktadır, bu da mikrotrombuslar ve plasental nekroza yol açar. Protein C ve fibrinopeptid A düzeylerinde de düşüklerden hemen önce bir düşüş görülmekte bu da koagulasyon mekanizmasının aktive olduğunu göstermektedi
Protrombin (Faktör II, FII) Geni Nedir
11p11-q12 yer alan Protrombin geni 14 ekzon ve 13 introndan oluşmuş 21 kilobaz büyüklüğünde bir gendir. Ekzonlar 25-315 baz, intronlar 84-9447 baz büyüklüğündedir. Gen de 5’-translasyonu yapılmayan (5’-UTR) ve 3’ translasyonu yapılmayan (3’-UTR) bölgeleri vardır. Gen de Protrombin yapımına engel olan pek çok mutasyon tanımlanmıştır
* Protrombin-BARCELONA
* Protrombin-TOKUSHIMA
* Protrombin-QUICK I
* Protrombin- QUIK II
* Protrombin-HIMI
* Protrombin-G20210A 1996 yılında Poort ve arkadaşları tarafından tanımlanan ve Protrombin geninin 3’-UTR bölgesinde bulunan 20210. nükleotitde guanin yerine adenin geçmesiyle oluşan G20210A mutasyonun plazma protrombin miktarının artmasına neden olduğu pek çok çalışmada gösterilmiştir (35, 38, 41, 63-65). Bu mutasyonun tromboz riskini 2.7-3.8 kat artırdığı ve venöz tromboz için en yaygın ikinci kalıtsal risk faktörü olduğu bildirilmiştir
Bu mutasyonu heterozigot olarak toplumda bulunma sıklığı %2-2.3 iken trombozlu hasta grubunda %6-6.2 ve ailede tromboz oykusu olanlarda %18 olarak tespit edilmiştir
Protrombin Proteini
Protrombin 72 kDa ağırlığında, 569 aminoasit içeren ve K vitamini varlığında karaciğerde sentezlenen tek zincirli bir glikoproteindir (73). Protrombinin yarılanma ömrü 1.25-3.5 gündür. Protrombin dört bölgeden oluşur; 1. Öncü dizi (271 aa), 2. Hafif zincir (49 aa), 3. Katalitik zincir (259 aa), 4. Dolaşıma katılmayan amino terminal zinciri (43 aa) (57). Protrombinin trombine dönüşümü tüm pıhtılaşma sistemindeki en karmaşık reaksiyon dizisidir.
Bu reaksiyonların gerçekleşe bilmesi için FXa, FVa, Ca++ ve fosfolipide ihtiyaç vardır
