Fiksatif Nedir, Günümüzde Kullanılan
Fiksatifler ve Özellikleri
Evrensel Fiksatif: Formalin
Uzunca bir süredir dünya genelinde, patoloji
laboratuvarlarında standart fiksatif olarak kullanılagelmiş bu kıymetli
solüsyonun patolojideki yerini anlayabilmek için, dokudaki etkisini ve bu
etkiyi nasıl gerçekleştirdiğini bilmek önemlidir. Dolayısıyla öncelikle, doku
formalin ile karşılaştığında kimyasal ve moleküler düzeyde nelerin olup
bittiğine göz atmak gerekir.
Formalin, formaldehitin sudaki %40’lık çözeltisidir.
Patoloji laboratuvarlarında, standart fiksatif olarak, 1 hacim formalinin
(formalinin, formaldehitin %40’lık çözeltisi olduğunu tekrarlamak istiyorum!) 9
hacim su ile karıştırılmasıyla elde edilen “%10’luk formalin” kullanılmaktadır.
Dolayısıyla %10’luk formalin, formaldehitin sudaki %4’lük çözeltisidir
(40/100x10/100=4/100).
Aldehitler olarak bilinen organik molekül
sınıfının en basit üyesi olan formaldehit (CH2O), solüsyon
içerisinde polimerize olma eğilimindedir. Yani, monomerik subünitler (CH2O)
bir araya gelerek, molekül ağırlığı daha yüksek agregatlar oluştururlar.
%10’luk formalin içerisinde ise, formaldehit genellikle monomerik formda
bulunur. Ancak fiksasyon ile polimerizasyon belirginleşmeye başlar ve
polimerizasyon ile de molekül ağırlığı artan formaldehit moleküllerinin
penetrasyon hızı yavaşlar (moleküler ağırlık ve penetrasyon hızı genellikle
ters orantılıdır). Bu nedenle de, üreticiler, polimerizasyonun önüne geçmeye
yardımcı olması amacıyla, formalin solüsyonuna metanol eklerler. Metanol her ne
kadar bir alkol olsa da (bir aldehit değil) görece formaldehite yakındır. İki
molekül arasındaki tek fark şudur: metanolde C ve O atomları tek bağ ile bağlı
iken (C-OH); aldehitte C ve O atomları çift bağ ile bağlıdır (H-C=O). Bu da
ayrıca metanolün vücuda neden toksik olduğunu gösterir. Sindirilmiş ya da
absorbe edilmiş metanol, vücutta formaldehite ve formaldehitin oksidasyon ürünü
olan formik asite oksidize edilir (oksidasyon zinciri
metanol-formaldehit-formik asit şeklinde gider).
Formaldehit, non-koagülan bir fiksatiftir. Dokuya
kimyasal olarak bağlanırken, kendinden sonra gelen belirtecin penetrasyonunu
engelleyecek jel-benzeri bir matriks oluşumuna neden olmaz. Formaldehitin
başlıca bağlandığı doku kısımları, aminoasitlerde (aa) bulunan reaktif hidrojen
atomlarıdır. Bütün aa’ler, molekülün bir ucunda bir amino grubu (-NH2)
ve diğer uçta ise bir karboksil grubu (-CO2H) içerir. Böylelikle bir
protein oluşturmak üzere biraraya gelip bağlandıklarında, proteinin bir ucu bir
amino grubu (N-terminali), diğer ucu ise bir karboksil grubu (C-terminali)
olacaktır. Formaldehit molekülü çoğunlukla, proteinlerin N-terminali ile
etkileşir ve protein molekülleri arasında metilen köprüleri (H-C-H) oluşturur.
N-terminali ile olan bu reaksiyonun, formalin solüsyonlarının pH’sına ve
aa’lerin biyokimyasal özelliklerine bağlı olduğu düşünülmektedir. Formaldehit
ayrıca aa sisteini içindeki sülfidril gruplarına da bağlanarak, proteinleri
daha ileri stabilize eden çapraz bağlar oluşturur. Bu köprüler ve çapraz bağlar,
dokuyu stabilize edip korumakla birlikte, çeşitli İHK prosedürlerinde epitop
açığa çıkarma (retrieval) basamağına ihtiyaç duyuran oluşumlardır.
Formalin fiksatif olarak kullanılırken, solüsyonun
pH’ı dikkat edilmesi gereken özelliklerdendir. Yukarıda da belirtildiği gibi,
formalin solüsyonu olağan pH aralığında iken, formaldehit molekülleri normal
olarak proteinlerin N-terminal ucu ile bağlanacaktır. Bu pH, genelde nötrale
yakındır. Bir formaldehit solüsyonunun pH’ı çok asidik olduğunda, bu solüsyona
maruz kalan kanlı dokularda, asidik ortamın hemoglobin üzerinde yaptığı etki
sonucu, koyu kahverengi/siyah renkli, insolubl, yapay bir pigment oluşur. Bu
pigment hematin (asit hematin, formalin pigmenti, formene) olarak
isimlendirilir. Bu nedenlerle, formalin solüsyonlarının pH’ı genelde 6’nın
üzerinde tutulur.
Formalin, atmosferik oksijene maruz kaldığında
formik aside oksidize olmaya meyilli olduğundan, solüsyonların çoğu hematin
pigment oluşumunu inhibe etmek için tamponlanır. Yaygın olarak kullanılan
tampon fosfattır (5). Etkili bir tamponlayıcı olmakla birlikte, fosfatı
formalin içinde kullanırken, fosfat çökeltisi oluşumunu önlemek amacı ile,
dehidrasyon işlemi maksimum %70 konsantrasyonda başlanmalıdır. Bu çökeltiler,
dokuda yapay kalıntılara neden olabilir ve daha fazlası, alkol tüpünde blokaja
neden olabilir. Bu oluşumu önlemek için, ilk alkolü %70 ya da daha düşük
tutmaya ek olarak, fosfat dışında bir başka tampon ile tamponlanmış formalin
solüsyonu da kullanılabilir. Bu fiksatifler fosfat-tamponlularla aynı sonuçları
verir ve fosfat çökelti oluşumu problemi de olmaz.
